侯曉瑋，莊興俊，宋 謙，李露嘉，王寧寧

在包括我國在內(nèi)的大多數(shù)國家，肺癌是占惡性腫瘤死因第一位的腫瘤［1］，約80%肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），大多數(shù)患者在初診時已是晚期或局部晚期，能行手術(shù)治療的患者不到30%［2］。晚期肺癌患者預(yù)后差，采用常規(guī)化療其平均生存期均不到1年［3］。近些年來應(yīng)用于臨床的針對表皮生長因子受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR）的靶向藥物如吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib），大大提高了晚期NSCLC患者的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者對靶向治療的反應(yīng)與EGFR基因突變的位點和類型密切相關(guān)，檢測患者EGFR基因突變狀態(tài)將為臨床治療選擇提供依據(jù)。如能通過安全、簡便的方法獲得足夠的組織標(biāo)本進行EGFR基因檢測，將有助于指導(dǎo)治療。

我科從2008年開始開展用活檢槍獲取肺組織標(biāo)本行組織學(xué)檢查技術(shù)，至今已開展CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)200余例，在明確肺腫瘤組織學(xué)分型的同時行EGFR基因突變檢測，方法簡便、可行，風(fēng)險小，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可以為晚期NSCLC患者靶向治療提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2011年10月至2012年8月，我們共對40例晚期NSCLC患者進行了CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)。其中男29例，女11例，年齡32～81歲，有吸煙史者25例。術(shù)前均經(jīng)CT檢查確定病灶。

1.2 方法

1.2.1 CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù) 術(shù)前常規(guī)行血常規(guī)、出凝血時間、凝血酶原時間、心電圖、肝腎功能、胸部CT檢查以確定適應(yīng)證及禁忌證。采用美國Agiotech帶外套管活檢槍套裝（18 G）。在CT引導(dǎo)下，根據(jù)占位病變所在部位確定患者體位，掃描病變局部，確定進針點、方向及深度，標(biāo)記穿刺點。在無菌操作下，用2%利多卡因局麻至胸膜進行穿刺，穿刺針到位后再行CT掃描，確定活檢槍套管在病灶中，將針芯抽出，插入活檢槍進行組織切割。一般重復(fù)取活檢2～3次，取得病變組織2～3條，用4%中性甲醛溶液固定送檢。操作完畢后用無菌敷料貼覆蓋穿刺點，CT掃描觀察有無氣胸或出血。

1.2.2 EGFR基因突變檢測 穿刺所取組織送檢病理科，經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片后，采用WHO肺癌分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2名病理科醫(yī)師確認(rèn)診斷NSCLC。確診NSCLC的石蠟包埋組織，以5 μm厚度連續(xù)切片共5片，采用QIAmp DNA FFPE試劑盒（Qiagen，Germany）按說明書操作提取基因組DNA，提取后測 A260、A260/280后放置于-20℃冰箱備用。采用巢式PCR擴增EGFR基因外顯子18、19、20、21。引物序列及 PCR條件參照參考文獻［4］。PCR產(chǎn)物采用DNA凝膠回收試劑盒進行純化。純化后的PCR產(chǎn)物用Bigdye v3.1kit（ABI）雙向測序。實驗方法均按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件，組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穿刺標(biāo)本的一般特征

40例患者均一次穿刺成功，穿刺結(jié)節(jié)最大徑平均為3.3 cm（1.4～6.5 cm），結(jié)節(jié)距體表平均深度為6.1 cm，每例穿刺取出組織2～4條，組織的長度為0.5～2 cm。40例穿刺標(biāo)本中，腺癌共24例（60.0%，24/40），鱗癌共 13 例（32.5%，13/40），神經(jīng)內(nèi)分泌癌共3例，其中大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例，1例為非典型類癌。

2.2 EGFR突變分析

在40例NSCLC標(biāo)本中，共檢測到EGFR基因突變15例（37.5%，15/40）。其中，11例為外顯子19突變，突變位點均為密碼子2235～2250缺失突變（19 DEL 2235~2250）；3 例為外顯子 21 突變，突變位點為位于密碼子2576位的點突變（21 T2576G）；1例為外顯子19、21均存在突變，突變位點為19 DEL 2235~2250和21 T2576G。

2.3 EGFR基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系

在40例NSCLC患者中，男性患者的EGFR基因突變率為41.4%（12/29），女性患者的突變率為27.3%（3/11），兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.480）。腺癌患者的EGFR基因突變率為50.0%（12/24），非腺癌患者突變率為 18.8%（3/16），兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.046）。吸煙患者的EGFR突變率為36%（9/25），不吸煙患者的突變率為40.0%（6/15），兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.800）。

2.4 經(jīng)皮肺穿刺活檢的主要并發(fā)癥

40例行經(jīng)皮肺穿刺活檢的病例，穿刺后氣胸并發(fā)率為7.5%（3/40），氣胸均發(fā)生在穿刺活檢時或活檢后半小時內(nèi)，無遲發(fā)性氣胸出現(xiàn)，氣胸經(jīng)過胸腔閉式引流后均在1周內(nèi)吸收；穿刺后咯血或血痰發(fā)生率為7.5%（3/40），穿刺相關(guān)性咯血均發(fā)生在拔出活檢針外套管后，經(jīng)止血藥物治療后，3例患者咯血癥狀均在穿刺后3 d內(nèi)消失，穿刺活檢術(shù)前因腫瘤本身原因存在咯血的病例，穿刺后未見咯血加重；拔除穿刺針后復(fù)查CT及穿刺術(shù)后3～4 h復(fù)查胸部X線片，均未見血胸、縱隔氣腫等并發(fā)癥；穿刺術(shù)中嚴(yán)格遵循無菌操作，且40例穿刺活檢病例均在穿刺術(shù)后酌情使用抗生素，所有病例在穿刺活檢術(shù)后均未發(fā)生感染；40例病例中，有38例患者成功進行隨訪，29例患者隨訪時間達3個月以上，每3個月復(fù)查胸部增強CT掃描，均未發(fā)現(xiàn)針道種植轉(zhuǎn)移病例，38例患者未發(fā)生與穿刺相關(guān)的死亡。

2.5 EGFR基因突變患者對分子靶向治療的反應(yīng)率

15例EGFR基因突變的患者均為初治，均在明確基因突變后即開始口服分子靶向藥物吉非替尼，目前服藥時間已超過3個月。其中，1例患者達到完全緩解（CR），9例患者達到部分緩解（PR），總有效率（CR+PR）為 66.7%（10/15）。 10例分子靶向治療有效的患者均為腺癌，3例EGFR基因突變的非腺癌患者均未在分子靶向治療中受益。

3 討論

目前研究已證實，分子靶向藥物的療效與EGFR基因突變密切相關(guān)，EGFR基因突變狀態(tài)成為晚期NSCLC患者選擇分子靶向治療的依據(jù)。但是，通過手術(shù)切除標(biāo)本進行EGFR基因檢測的患者往往只占少數(shù)，超過70%NSCLC患者因在確診時已進入中晚期，無法接受手術(shù)治療，從而無法獲得手術(shù)切除腫瘤組織標(biāo)本進行基因檢測，這使得相當(dāng)一部分晚期NSCLC患者無法獲得分子靶向治療的確切證據(jù)，盲目進行分子靶向治療會增加患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，或者使患者錯失放化療等其他有效治療的良機。近些年來，國內(nèi)外也有許多學(xué)者比較了肺癌患者血清循環(huán)DNA與腫瘤組織EGFR基因突變的一致性，結(jié)果顯示兩種檢測手段的一致性在70%左右［5-6］，雖然通過血清DNA檢測患者EGFR基因也有較高的敏感性，但單純檢測血清DNA的EGFR基因如果出現(xiàn)假陰性結(jié)果，仍會使部分患者喪失通過分子靶向治療獲益的機會。因此，通過腫瘤組織穿刺活檢檢測EGFR突變?nèi)允悄壳白顬榭煽康氖侄?，而獲得足夠的腫瘤組織則是目前無法手術(shù)的晚期NSCLC患者進行EGFR基因檢測所面臨的問題。

經(jīng)皮肺穿刺活檢確定肺內(nèi)病變組織來源與性質(zhì)是一項成熟的微創(chuàng)診斷技術(shù)。隨著新的影像學(xué)引導(dǎo)技術(shù)的進步和穿刺針的不斷改進，經(jīng)皮肺穿刺活檢的診斷率和安全性也不斷提高。我科自2011年開始開展了CT引導(dǎo)經(jīng)皮肺穿刺活檢檢測NSCLC患者EGFR基因突變的研究。本研究中，我們采取18 G自動活檢槍對40例NSCLC患者共40處肺癌結(jié)節(jié)進行活檢取材，成功率達100%，所獲得組織制備成組織蠟塊，進行病理學(xué)確診后，剩余組織足夠用于進行基因組DNA抽提及EGFR基因檢測。

關(guān)于利用穿刺活檢技術(shù)獲取組織進行基因檢測的可行性，國外亦有相似研究予以證實。Ellis等［7］報道采用14 G細(xì)針穿刺乳腺組織，可獲得約1.34 μg的總RNA，足夠用于進行組織微陣列分析。Chen等［8］同樣證實了采用18 G活檢槍取3條肺癌組織足夠進行EGFR突變檢測。Solomon等［9］同時比較了細(xì)針穿刺活檢組織和通過手術(shù)切除標(biāo)本檢測肺癌EGFR和KRAS基因突變，結(jié)果具有100%的一致性。莊一平等［10］的小樣本研究也證實了肺穿刺活檢標(biāo)本用于肺癌EGFR基因檢測的應(yīng)用價值。本研究中，我們采用18 G全自動活檢槍進行取材，根據(jù)病灶大小和深度，所取組織條數(shù)為2～4條，長度范圍在0.5～2.0 cm，40例病例均成功進行EGFR基因檢測，EGFR基因的突變率為37.5%，突變發(fā)生在外顯子19和外顯子21，未檢測到外顯子18和20的突變，突變類型主要為外顯子19的缺失突變DEL 2235~2250和外顯子21的點突變T2576G，與文獻報道結(jié)果一致［11］。本研究也發(fā)現(xiàn)腺癌患者的突變率明顯高于非腺癌患者，與之前的研究結(jié)果相符。但是本研究中吸煙患者與不吸煙患者，以及男性患者與女性患者之間突變率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這與目前大部分報道不符。分析原因可能與本研究所入組的病例數(shù)相對較少相關(guān)，同時因入組患者大部分來自青島沿海地區(qū)，也不能排除地域環(huán)境因素影響，未來我們將會繼續(xù)擴大樣本數(shù)進一步闡明此問題。

本研究中，我們同時觀察了經(jīng)肺穿刺活檢證實存在EGFR基因突變的患者對靶向藥物吉非替尼的治療反應(yīng)，結(jié)果表明，吉非替尼治療15例突變患者的總有效率達到66.7%，且服用吉非替尼治療有效的患者均為腺癌患者，結(jié)果與國內(nèi)外大多數(shù)報道相符。同時，有2例未檢測到EGFR基因突變的患者，因體力狀況差等原因無法耐受化療，也接受了吉非替尼治療，但病情均在3個月內(nèi)進展。因此，這一結(jié)論可進一步證實通過肺穿刺活檢所獲得組織檢測EGFR基因突變的準(zhǔn)確性和實用性。

與乳腺等組織不同，肺穿刺活檢最常見的并發(fā)癥為氣胸。我科自2007年開展經(jīng)皮穿刺活檢技術(shù)，總結(jié)經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)在有吸煙史并存在肺大泡的患者中，氣胸發(fā)生率較高，因此，在本研究中，我們采用較細(xì)的18 G穿刺針，在CT定位過程中盡可能選擇最短的穿刺路徑，并盡量避開肺大泡，在穿刺前即教育患者練習(xí)術(shù)中屏氣，通過以上措施，僅有3例患者穿刺后發(fā)生氣胸，經(jīng)胸腔置管閉式引流后均在1 d后拔管痊愈。對于穿刺術(shù)后出現(xiàn)血痰或咯血的患者，在穿刺結(jié)束拔針后復(fù)查CT可見針道少量出血，經(jīng)對癥治療癥狀均在3 d內(nèi)消失，且發(fā)生針道出血的患者并發(fā)氣胸的可能性更小，因此我們認(rèn)為針道出血和咯血對患者的生活質(zhì)量并無影響。同樣，經(jīng)過隨訪，CT檢查并未發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)針道種植及感染等并發(fā)癥。綜上，我們認(rèn)為CT引導(dǎo)的經(jīng)皮肺穿刺活檢技術(shù)操作簡便、安全性高，是晚期NSCLC獲得腫瘤組織檢測EGFR基因突變的可靠方法。

［1］Spiro SG，Porter JC.Lung cancer—where are we today？ Current advances in staging and nonsurgical treatment ［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，166：1166-1196.

［2］Datta D，Lahiri B.Preoperative evaluation of patients undergoing lung resection surgery［J］.Chest，2003，123： 2096-2103.

［3］Schiller JH，Harrington D，Belani CP，et al.Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small-cell lung Cancer［J］.N Engl J Med，2002，346： 92-98.

［4］Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al.EGFR mutations in lung Cancer： correlation with clinical response to gefitinib therapy［J］.Science，2004，304： 1497-1500.

［5］Brevet M，Johnson ML，Azzoli CG，et al.Detection of EGFR mutations in plasma DNA from lung Cancer patients by mass spectrometry genotyping is predictive of tumor EGFR status and response to EGFR inhibitors ［J］.Lung Cancer，2011，73： 96-102.

［6］Kimura H，Kasahara K，Kawaishi M，et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-smallcell lung Cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12： 3915-3921.

［7］Ellis M，Davis N，Coop A，et al.Development and validation of a method for using breastcoreneedlebiopsiesforgene expression microarray analyses ［J］.Clin Cancer Res，2002，8：1155-1166.

［8］Chen CM，Chang JW，Cheung YC，et al.Computed tomographyguided core-needle biopsy specimens demonstrate epidermal growth factor receptor mutations in patients with non-small-cell lung Cancer［J］.Acta radiol，2008，49： 991-994.

［9］Solomon SB，Zakowski MF，Pao W，et al.Core needle lung biopsy specimens：adequacy for EGFR and KRAS mutational analysis［J］.Am J Roentgenol，2010，194： 266-269.

［10］莊一平，張 晉，史美祺，等．CT導(dǎo)向肺癌穿刺標(biāo)本表皮生長因子受體基因突變檢測的應(yīng)用價值 ［J］．介入放射學(xué)雜志，2011，20： 276-278．

［11］ Pao W，Miller VA.Epidermal growth factor receptor mutations，small-molecule kinase inhibitors，and non-small-cell lung Cancer： current knowledge and future directions ［J］.J Clin Oncol，2005，23： 2556-2568.