錢玲玲， 秦玉梅， 鄧少平

（浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州310035）

20世紀初甜味受體的發(fā)現(xiàn)，揭開了人類研究甜味感受機理的新篇章，研究者開始從甜味受體的結(jié)合與激活角度分析甜味劑結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系[1]。甜味受體T1R2和T1R3以異二聚體的形式共表達參與甜味識別，對多種天然糖及各種人工甜味劑具有高親和力，是一種廣譜的甜味感受器[2-4]。當不同的甜味物質(zhì)與T1R2/T1R3受體作用時，或通過激活G蛋白的α亞基，或通過激活α亞基導致與β、γ亞基的分離，從而引起各下游信號分子途徑的開放，最終導致細胞膜去極化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[5-6]，產(chǎn)生甜味感知。

甜味受體的發(fā)現(xiàn)，也使各種新技術(shù)如分子模擬、異源表達、離子影像及膜片鉗電生理技術(shù)[7-10]等如雨后春筍般地涌現(xiàn)出來。作者所在實驗室則利用近年來發(fā)展起來的等溫量熱滴定（ITC）技術(shù)手段，對細胞水平上甜味感受的熱動力學進行研究，以期從新的角度詮釋甜味識別機理。以味細胞以及NCIH716作為味細胞的替代細胞[11]為對象，確定了用于細胞甜味識別熱力學研究的等溫量熱滴定各種實驗條件；系統(tǒng)的研究了不同濃度的同種甜味劑、同種濃度不同甜味劑與味蕾細胞相互作用的熱力學行為；證明了ITC作為一種新型實驗手段在活細胞層面上通過熱力學參量研究受體與配體分子相互作用的物理化學機制的可行性，在甜味識別的熱動力學機制方面做了開創(chuàng)性工作。但不論是原代味細胞還是替代細胞，由于細胞中蛋白質(zhì)成分的復(fù)雜性及細胞的不穩(wěn)定性，使得甜味劑與甜味受體相互作用時信號較弱，從而影響了實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

作者利用異源表達受體蛋白質(zhì)技術(shù)，通過提取總RNA、擴增目的基因和重組表達載體，將甜味受體蛋白基因?qū)際EK293細胞，通過篩選獲得能夠穩(wěn)定、單一地表達甜味受體蛋白的細胞系，從而為ITC實驗的順利進行提供細胞來源，以期實現(xiàn)細胞水平上甜味識別熱動力學規(guī)律研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、質(zhì)粒和細胞株 6～8周大C57BL/6J小鼠:SPF級，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心； 大腸桿菌 Stbl3、pEGFP-C1、pDsRed1-N1、pcDNATM6.2/N-YFP-DEST質(zhì)粒:購自美國Invitrogen公司；HEK293細胞系:由作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑、PCR試劑盒、Marker、T4連接酶和內(nèi)切酶:均購自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑:購自美國Invitrogen公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒:購自O(shè)MEGA公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清:購自美國Gibco公司；Gustducin兔多克隆抗體:購自美國Santa Cruz公司；T1R2/T1R3鼠單克隆抗體:購自美國Abcam生物技術(shù)公司；二抗:購自上海艾比馬特公司；預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準、PVDF膜:購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠舌組織mRNA的提取 取6～8周大C57BL/6J小鼠置于密閉容器中，通入N2致死，取舌組織，立即投入液氮中，后放入預(yù)冷的研缽，研磨至粉末狀。在液氮基本揮發(fā)完時，加入Trizol，繼續(xù)研磨至粉末，粉末呈液態(tài)狀后，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中冰上勻漿。最后根據(jù)mRNA提取操作方法獲取總mRNA。RNA樣品短期內(nèi)于-20℃保存，長期則-80℃保存。

1.2.2 Gα15、T1R2與 T1R3基因的克隆 參考NCBI上Gα15、T1R2與T1R3的蛋白編碼全序列，再結(jié)合初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CDS區(qū)序列，使用Prime primer 5.0軟件設(shè)計引物，并在正反向引物的5’端分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點，設(shè)計所得引物見表1。引物由上海生工生物公司合成。以小鼠總mRNA為模板，通過RT-PCR擴增長度為1 124 bp的Gα15基因，以及長度分別為2 531、2 576 bp的T1R2和T1R3基因。反轉(zhuǎn)錄條件為65℃5 min、冰浴 5 min 變性、退火，30 ℃ 10 min；42 ℃ 25 min；95℃5 min終止反應(yīng)。PCR條件為94℃5 min；98℃10 s，68 ℃（Gα15、T1R2、T1R3 退火溫度分別為 68、61、63 ℃）30 s，72 ℃ 1 min/kbp，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳后回收純化PCR產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 設(shè)計所得Gα15、T1R2、T1R3引物Table 1 Primers designed for Gα15，T1R2，T1R3

1.2.3 表達載體的構(gòu)建 用EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切目的基因 Gα15、T1R2與 T1R3，以及質(zhì)粒pEGFP-C1、pDsRed1-N1 與 pcDNATM6.2/N-YFPDEST，然后T4連接酶16℃反應(yīng)過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化自制Stbl3感受態(tài)。氨芐青霉素及卡那霉素培養(yǎng)板篩選出陽性克隆，最后重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、Xho I和EcoR I雙酶切及送上海生工生物公司進行測序鑒定。

1.2.4 穩(wěn)定株的構(gòu)建與篩選 取生長狀態(tài)良好的HEK293細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)，當匯合度達到40%～50%時進行轉(zhuǎn)染。將重組表達質(zhì)粒 Gα15-pEGFP-C1與 lipofectamine混合的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到已鋪好HEK293細胞的培養(yǎng)皿中進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，移除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，取部分觀察GFP熒光，按照極限稀釋法篩選出細胞株后，加入G418至終質(zhì)量濃度為5 μg/mL。同時將沒有轉(zhuǎn)染的細胞作為空白對照，加入含G418質(zhì)量濃度為4 μg/mL的選擇培養(yǎng)基。當對照組細胞全部死亡后，將實驗組G418質(zhì)量濃度降為2 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)2周，篩選出的抗性單克隆株繼續(xù)篩選5 d，挑取單克隆，進行擴大培養(yǎng)。再以相同的方法將 T1R2和T1R3共轉(zhuǎn)染 Gα15/HEK293 細胞。 其中 G418 為 5 μg/mL，neomycin 與滅稻瘟素質(zhì)量濃度各4 μg/mL。

1.2.5 RT-PCR檢測目標基因表達水平 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 Gα15/T1R2/T1R3/HEK 293細胞，利用RNAiso PLUS試劑提取細胞總mRNA，以GAPDH基因為內(nèi)參基因，利用自行設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)，擴增出目的基因。PCR擴增程序設(shè)為:95℃30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃（Gα15、T1R2、T1R3 退火溫度分別為 65、59、63 ℃）34 s，72 ℃ 1 min/kbp，40 個循環(huán)；72℃ 5min。

1.2.6 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Gα15/T1R2/T1R3/HEK293細胞，常規(guī)培養(yǎng)，提取細胞蛋白質(zhì)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜，封閉2 h，然后依次與一抗（1∶1 000比例稀釋）和二抗（1∶5 000比例稀釋）反應(yīng)，最后化學發(fā)光，凝膠系統(tǒng)拍照獲取結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠舌組織總mRNA提取結(jié)果

實驗提取C57BL/6J小鼠的總mRNA，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。其中28S的條帶的亮度和寬度大約為18S條帶的兩倍，說明該總mRNA樣品完整性好且降解較少。因此本實驗所得到的小鼠總mRNA可以作為RT-PCR模板。

圖1 小鼠舌組織總mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total mRNA products

2.2 目的基因PCR擴增結(jié)果

以小鼠總mRNA為模板，利用自行設(shè)計的Gα15、T1R2及T1R3引物，進行RT-PCR擴增，預(yù)計分別獲得長度為1 124、2 531、2 576 bp的目的片段，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。發(fā)現(xiàn)經(jīng)PCR擴增后，獲得目的基因片段大小與預(yù)計大小基本一致。

2.3 重組表達質(zhì)粒的鑒定

pEGFP-C1-Gα15、pDsRed1-N1-T1R2 和pcDNATM6.2/N-YFP-DEST-T1R3重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I和 EcoR I雙酶切后，將分別產(chǎn)生長度為1 124、2 531、2 576 bp 的 Gα15、TIR2、T1R3 目的基因片段及相應(yīng)的載體片段。雙酶切結(jié)果見圖3、圖4。將重組表達質(zhì)粒送往上海生工生物公司測序，測序結(jié)果與源序列比對后發(fā)現(xiàn)，Gα15與TIR2同源性達到100%，僅T1R3在2 545 bp位點發(fā)生一個位點突變，經(jīng)密碼子翻譯后，所編碼的氨基酸種類保持不變，屬于同義突變，證明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

圖3 pEGFP-C1-Gα15重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of double digestion productsofpEGFP-C1-Gα15recombinant plasmid

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果鑒定

按比例將 PEGFP-Gα15表達載體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中。以成功構(gòu)建的Gα15/HEK293細胞為基礎(chǔ)，將pDsRed1-N1-T1R2與pcDNATM6.2/NYFP-DEST-T1R3表達載體共轉(zhuǎn)染至 Gα15/HEK293細胞中，經(jīng)單克隆篩選后，將細胞置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察GFP/YFP/RFP熒光，結(jié)果見圖 5。 結(jié)果說明，PEGFP-Gα15、pDsRed1-N1-T1R2與pcDNATM6.2/N-YFP-DEST-T1R3三種表達載體已被成功轉(zhuǎn)入HEK293細胞且轉(zhuǎn)染效率良好。

圖 4 pDsRed1-N1-T1R2、pcDNATM6.2/N-YFP-DESTT1R3重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of double digestion products of pDsRed1-N1-T1R2、pcDNATM6.2/NYFP-DEST-T1R3 recombinant plasmids

圖5 穩(wěn)定表達Gα15/T1R2/T1R3的HEK293細胞Fig.5 HEK293 cells express Gα15/T1R2/T1R3.Scale bar represent 30μm in A-D

2.5 RT-PCR 檢測 Gα15、T1R2、T1R3表達結(jié)果

所得內(nèi)參基因 GAPDH和 Gα15、T1R2、T1R3 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后，電泳條帶分別位于 400、1 124、2 531、2 576 bp 左右位置，與實際長度基本一致，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

圖7 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

2.6 Western blot蛋白質(zhì)表達檢測結(jié)果

表達產(chǎn)物經(jīng)Western blot鑒定結(jié)果見圖8。

圖8 Western Blot 結(jié)果Fig.8 Western Blot results

與空白對照組相比，穩(wěn)定細胞株HEK293可以檢測到Gα15，T1R2，T1R3。因此表明所篩選出來的HEK293細胞穩(wěn)定表達了 Gα15，T1R2以及 T1R3蛋白。

3 結(jié) 語

甜味劑是一類重要的食品添加劑，它賦予食品以甜味。目前人工合成甜味劑在日常食品中應(yīng)用范圍越來越廣，使用量越來越大，同時人工合成甜味劑的安全性一直是各國政府和相關(guān)科研機構(gòu)所關(guān)注的熱點[12]。大批科學家正在從各個方面尋找方法詮釋甜味感受的機制，不僅用來指導新型甜味劑的開發(fā)，也利于研究甜味劑的安全性。近年來發(fā)展起來的等溫滴定微量技術(shù)（ITC），通過一次實驗便可提供熱力學和動力學信息[13-14]。作者所在實驗室即利用ITC，研究了細胞水平甜味感受的熱動力學機制，從新的角度進一步研究甜味感受機制。通過前期研究[15]發(fā)現(xiàn)，要實現(xiàn)甜味識別熱力學機制的詮釋，穩(wěn)定單一的細胞來源是實驗的前提保障。異源表達技術(shù)在甜味機理研中究發(fā)揮著重要作用[10]，所以作者所在實驗利用異源表達技術(shù)以C57BL/6J小鼠舌組織提取的總RNA為模板，擴增了甜味受體T1R2和T1R3，以及甜味受體偶聯(lián)的G蛋白α15亞基；選擇 pEGFP-C1、pDsRed1-N1、pcDNATM6.2/N-YFPDEST構(gòu)建表達，因上述質(zhì)粒表達特定的熒光蛋白，簡化了轉(zhuǎn)染效率的檢測及穩(wěn)定表達細胞株的篩選，最后利用PCR與Western Blot技術(shù)證明，構(gòu)建了穩(wěn)定表達甜味受體蛋白T1R2/T1R3的Gα15/HEK293細胞株，從而為研究生物動力學和生物熱力學提供了穩(wěn)定的細胞來源。為甜味機理研究提供了良好的材料，也為細胞水平上的其他研究提供方法學基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)晶體的獲得成為了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能特性研究的瓶頸問題[16]。甜味研究亦是如此。作者成功構(gòu)建了穩(wěn)定單一表達甜味受體的細胞株，同時也為獲得甜味受體蛋白提供了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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