徐全中， 王偉佳， 闞麗娟， 嚴(yán)海忠， 幕月晶， 歐陽(yáng)能量， 黃燕華， 張秀明

(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山528403)

降鈣素原(procalcitonin，PCT)是無(wú)激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，是由116個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為13 000［1］的糖蛋白。在生理情況下，主要是由甲狀腺濾泡細(xì)胞產(chǎn)生，其濃度通常＜0.1 ng/mL［2］。1993 年，Assicot 等［3］首先提出PCT可以作為細(xì)菌感染的標(biāo)志物。嚴(yán)重感染患者的PCT顯著升高，并與感染的嚴(yán)重程度及臨床預(yù)后密切相關(guān)［4］。其在感染后2～4 h即可升高，8～24 h就可以升高到峰值，并且其半衰期較長(zhǎng)(20～24 h)，近年來PCT在提示細(xì)菌感染及其感染程度、判斷治療效果、指導(dǎo)抗菌藥物治療等方面發(fā)揮了重要的作用。作為臨床實(shí)驗(yàn)室，對(duì)PCT檢測(cè)時(shí)選擇何種抗凝劑、采血后多長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)仍然有效和如何有效的保存標(biāo)本是我們關(guān)心的問題，我們對(duì)此進(jìn)行了探討。

材料和方法

一、材料

采血管采用BD公司的真空采血管。肝素鋰管批號(hào)為1213622，抗凝劑為75 USP Units;乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)管批號(hào)為1146897，抗凝劑3.6 mg;分離膠管批號(hào)為1179948;普通干燥管批號(hào)為1167597。Roche Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品(試劑批號(hào)為162192;校準(zhǔn)品批號(hào)為162192;質(zhì)控品批號(hào)為低值16195300，高值16195400)和配套消耗品。

二、方法

1.Roche Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)PCT的精密度驗(yàn)證 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的EP15-A2文件《用戶對(duì)精密度和準(zhǔn)確度性能的核實(shí)試驗(yàn)2批準(zhǔn)指南》［5］，選用5個(gè)不同濃度的標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本每天重復(fù)測(cè)定4次，持續(xù)5 d。計(jì)算分析內(nèi)不精密度為1.04%，總不精密度為1.21%。儀器完全滿足臨床檢測(cè)需要。

2.血液標(biāo)本的采集 疑似細(xì)菌感染的住院患者13例，其中男7例，女6例，平均年齡45歲。空腹抽取靜脈血分別注入真空干燥管、分離膠管、肝素鋰管和EDTA-K2管中。普通干燥管和分離膠管室溫(20～25℃)放置30 min，待血液凝固后1 300×g離心10 min分離血清，肝素鋰管和EDTA-K2管顛倒混勻后即刻1 300×g離心10 min分離血漿。分離的血清或血漿各分裝若干份于EP管密封備用。

3.分析方法 (1)不同抗凝劑對(duì)PCT檢測(cè)結(jié)果的影響分析:用Roche Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)13例分裝于真空干燥管、分離膠管、肝素鋰管和EDTA-K2管分離的患者血清或血漿分別在即刻、12、24和72 h進(jìn)行測(cè)定;(2)不同保存溫度和保存時(shí)間對(duì)PCT檢測(cè)結(jié)果的影響分析:用前一步選出的最適采血管，采集9例疑似細(xì)菌感染的住院患者(其中男4例，女5例，平均年齡41歲)血清或血漿，分別置于4、－30和－70℃保存，即刻分離血清或血漿時(shí)測(cè)定1次，4℃保存的標(biāo)本分別在12 h、24 h、72 h、7 d進(jìn)行測(cè)定，－30和－70℃保存的標(biāo)本分別在24 h、72 h、7 d進(jìn)行測(cè)定(－70℃保存的標(biāo)本在7 d進(jìn)行檢測(cè)之前反復(fù)凍融2次)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、血清和不同抗凝劑的血漿檢測(cè)結(jié)果

比較13例標(biāo)本不同采血管的即刻檢測(cè)結(jié)果，差異均不超過15%。EDTA-K2是試劑盒推薦的抗凝劑，并且以EDTA-K2抗凝的血漿PCT在72 h內(nèi)的降解速率最慢，以EDTA-K2抗凝血漿即刻檢測(cè)平均濃度作為百分百標(biāo)準(zhǔn)參照，普通干燥管檢測(cè)平均濃度為102.84%，有+2.84%的差異;分離膠管為111.47%，有+11.47%的差異，肝素鋰管為97.24%，有－2.76%的差異。

二、血清和不同抗凝劑的血漿在不同放置時(shí)間的降解百分率

13例標(biāo)本不同采血管分離的血清或血漿室溫下放置，12 h時(shí) EDTA-K2管平均降解了(2.61±0.56)%，比較其他采血管，其降解速率最慢。分離膠管平均每小時(shí)降解0.46%，降解最快。在24 h時(shí)，普通干燥管、分離膠管、肝素鋰管、EDTA-K2管分別平均降解了(9.66±1.60)%、(11.01±1.62)%、(8.00±0.91)%、(3.86±0.76)%。放置72 h時(shí)，分離膠管平均降解率達(dá)到(41.25±1.68)%，仍為降解最快，而 EDTA-K2管則僅平均降解(15.77±1.65)%。見圖1。

三、EDTA-K2抗凝血漿不同保存溫度下不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

9例EDTA-K2抗凝標(biāo)本即使存放于4℃，在7 d時(shí)與分離血漿即刻測(cè)定差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);存放于－70℃，7 d疊加反復(fù)凍融2次對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。見表1。

討 論

健康成人血中的PCT濃度很低，但在嚴(yán)重的全身感染時(shí)可以在2～4 h升高，并且很快就可以達(dá)到峰值。Müller等［6］通過對(duì)79例懷疑感染的住院兒童進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重感染(細(xì)菌、寄生蟲或真菌感染)并有全身表現(xiàn)時(shí)，血PCT含量明顯升高，而病毒感染和局部細(xì)菌感染沒有全身表現(xiàn)的患者血PCT含量水平僅輕度升高。另外，監(jiān)測(cè)血PCT水平還有助于臨床正確、合理使用抗菌藥物［7］。由于其在鑒別系統(tǒng)感染和非感染性炎癥，及其嚴(yán)重程度、抗菌藥物治療、預(yù)后等方面發(fā)揮的重要作用，使其成為臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。臨床常用血清作為檢測(cè)標(biāo)本，而在急診檢驗(yàn)工作中，多數(shù)用血漿標(biāo)本做檢驗(yàn)，用血漿作為標(biāo)本的優(yōu)點(diǎn)在于可以立即離心，縮短血液分離時(shí)間［8］。不同的抗凝劑、不同的存放條件和不同的存放時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果是否有影響以及影響大小還不清楚。1997年Meisner等［9］曾對(duì)PCT檢測(cè)的影響因素做過研究，但其對(duì)有些影響因素(抗凝劑種類、標(biāo)本的保存溫度和保存時(shí)限)的研究還是比較局限，國(guó)內(nèi)可以作為一定的參考但未必適用，國(guó)內(nèi)是怎樣的情況鮮有報(bào)道，為此我們對(duì)該方面做了進(jìn)一步的探討。

在對(duì)普通干燥管、分離膠管、肝素鋰管和EDTA-K2管的研究中，肝素鋰管比EDTA-K2管偏低2.76%。曾有報(bào)道，肝素對(duì)標(biāo)記免疫分析影響程度的高低因方法與檢測(cè)項(xiàng)目不同而不同［10-11］。本試驗(yàn)使用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，可能是由于肝素具有強(qiáng)酸性并帶有負(fù)電荷，會(huì)影響化學(xué)反應(yīng)的催化環(huán)境、緩沖體系甚至是化學(xué)反應(yīng)本身，使其檢測(cè)結(jié)果偏低。普通干燥管和分離膠管測(cè)定結(jié)果比 EDTA-K2抗凝管結(jié)果分別偏高 2.84%、11.47%，至于造成這種差異的具體原因不明，還有待進(jìn)一步探討。用普通干燥管、分離膠管、肝素鋰管、EDTA-K2管處理的血液標(biāo)本，分離后室溫存放，在12、24和72 h測(cè)定均是EDTA-K2抗凝血標(biāo)本降解速率最慢，前12 h平均每小時(shí)降解速率不足0.22%，即使存放 72 h也才降解(15.77±1.65)%，平均每小時(shí)降解速率與前12 h每小時(shí)降解速率基本一致。EDTA-K2抗凝血標(biāo)本存放于4、－30和－70℃條件下，在7 d內(nèi)基本無(wú)降解，甚至在－70℃條件下保存即使反復(fù)凍融2次對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響也很有限。

為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、及時(shí)、有效，可以從提高檢驗(yàn)人員的業(yè)務(wù)水平、改進(jìn)工作流程、縮短檢測(cè)時(shí)間等方面來減少標(biāo)本放置時(shí)間過長(zhǎng)帶來的影響。血漿中的PCT非常穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)室可用常規(guī)的方法進(jìn)行收集，無(wú)需特殊的儲(chǔ)存條件。作為電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，本研究證實(shí)采用EDTA-K2作為抗凝劑采集標(biāo)本不但縮短了標(biāo)本檢測(cè)，而且檢測(cè)結(jié)果良好，并且長(zhǎng)時(shí)間保存只具有很小的降解速率。但為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用其各自方法推薦的抗凝劑在推薦的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

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