代巧玉，康 丁，張洪斌

上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 200240

甘草是一種古老而應(yīng)用廣泛的中草藥，它在包括中國(guó)、日本、英國(guó)等國(guó)家的藥典中均有記載，甘草還作為添加劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)［1］。甘草屬植物的科學(xué)研究始于20世紀(jì)60年代，目前已從甘草物種中提取出超過(guò)400種化合物。甘草具有抗?jié)儯?］、抗炎［3］、抗痙攣［4，5］、抗氧化［6］、抗過(guò)敏［7］、抗病毒［8］、抗癌［9］、抗抑郁［10］、抗血管增生［11］、保護(hù)肝臟［12］以及加強(qiáng)記憶力［13］等藥理學(xué)活性，其中三萜皂苷和黃酮類化合物被認(rèn)為是其中的活性成分［14］。甘草中還存在一類重要的活性大分子成分——甘草多糖，研究表明，甘草的免疫調(diào)節(jié)、吞噬作用、抗補(bǔ)體作用、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等性質(zhì)都與甘草多糖有關(guān)［15，16］。甘草小分子活性物質(zhì)的相關(guān)報(bào)道較多，本文則著重綜述水溶性甘草多糖大分子的分離提取和純化、結(jié)構(gòu)解析以及藥理活性研究的最新進(jìn)展。

1 水溶性甘草多糖的分離提取與純化

目前文獻(xiàn)中涉及的水溶性甘草多糖的提取方法包括水煎煮法［17，18］、超聲法［19，20］、酶法［21］和微波輔助法［22，23］。相對(duì)于水煎煮法，超聲法可提高提取率，酶法則可在較溫和的條件下進(jìn)行，且酶具有高度特異性，不會(huì)對(duì)中藥中的有效成分造成破壞。微波輔助法也可在較低的溫度下完成萃取過(guò)程，能夠有效保護(hù)提取成分的質(zhì)量。

采用上述方法獲得的甘草多糖只是粗多糖，還需進(jìn)行去蛋白、去除小分子等純化過(guò)程。最后將多糖進(jìn)行分級(jí)來(lái)獲得均一的組分［24-26］。蛋白質(zhì)的去除方法通常有Sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法、酶法、鹽酸法和鞣酸法。這些方法可以單獨(dú)使用，也可以兩種或多種方法結(jié)合使用。甘草多糖的純化方法主要有分級(jí)沉淀［27］、季銨鹽沉淀法［28，29］、凝膠柱層析和離子交換色譜法［25，30］等。

2 水溶性甘草多糖的結(jié)構(gòu)分析

多糖結(jié)構(gòu)的詳細(xì)表征通常較困難，這是由于構(gòu)成多糖結(jié)構(gòu)單元的單糖的種類多，連接位點(diǎn)和糖苷鍵類型多樣，多糖還常常具有復(fù)雜的鏈分支結(jié)構(gòu)。目前對(duì)甘草多糖的結(jié)構(gòu)分析尚限于一級(jí)結(jié)構(gòu)的解析，主要涉及結(jié)構(gòu)單元信息和基本的糖苷鍵連接方式，而對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)知之甚少。

關(guān)于組成單元，有報(bào)道認(rèn)為甘草多糖為α-(1→4)-D-葡聚糖［24，25］，但更多的研究表明其為雜多糖［31-36］。Tomoda等［31-33］對(duì)甘草中提取的 3 種水溶性多糖UA、UB和UC進(jìn)行分析認(rèn)為，3種水溶性多糖所含單糖種類和組成比各異，按L-樹(shù)膠醛糖∶D-半乳糖∶D-葡萄糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸組成比順序，UA 為22∶14∶0∶1∶3，而 UB 為12∶10∶1∶10∶20，UC為10∶30∶27∶1∶0。還有報(bào)道認(rèn)為甘草多糖由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，以葡萄糖為主［34］。近期則有報(bào)道認(rèn)為甘草多糖含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖，不含甘露糖［35］，以及主要由α-D-葡萄糖、α-L-阿拉伯糖和 α-D-半乳糖組成，摩爾組成比為 8.0∶1.8∶1.0［36］。

關(guān)于鏈結(jié)構(gòu)，Tomoda等［31-33］認(rèn)為UA主體結(jié)構(gòu)是以β-1，3連接的D-半乳糖為主鏈，在半乳糖單元的六位上都有以 α-1，5-阿拉伯糖-β-1，6 或者 1，3 連接的半乳糖殘基為主的側(cè)鏈;UB結(jié)構(gòu)上與UA類似，但是其主體結(jié)構(gòu)是支化的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，而UC是一種阿拉伯糖-3，6-半乳葡聚糖型的多糖。Tomoda等［29，37］還從光果甘草的匍匐莖中分離出一種酸性多糖(GA)，認(rèn)為其結(jié)構(gòu)特征主要包括α-阿拉伯糖-β-3，6-半乳糖型的結(jié)構(gòu)單元，GA 的主體結(jié)構(gòu)具有一個(gè)β-1，3連接的D-半乳糖殘基的主鏈，主鏈中3/5的半乳糖單元在6號(hào)碳上連接一個(gè)由β-1，3和β-1，6連接的半乳糖基殘基組成的側(cè)鏈。孫潤(rùn)廣等［38］借助原子力顯微鏡分析認(rèn)為甘草多糖具有螺旋結(jié)構(gòu)，有至少3種主要的核心結(jié)構(gòu)，一是以葡萄糖為主鏈，通過(guò)α-(1，4)鍵連接的單一葡萄糖結(jié)構(gòu)，二是以1，3-D-半乳糖組成的主鏈，在主鏈半乳糖某單元的6位上帶有由1，6-半乳糖殘基組成的側(cè)鏈分支，以及以1，3-D-半乳糖組成主鏈，在主鏈所有半乳糖單元的6位帶有由α-1，5-連接的L-阿拉伯糖殘基組成的側(cè)鏈。

由上述可見(jiàn)，依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，甘草中水溶性多糖有多種，一般為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的支化雜多糖。盡管主鏈結(jié)構(gòu)可能單一，但現(xiàn)有研究并不能排除主鏈為雜多糖鏈的可能性，也不能提供側(cè)鏈取代位置、分布和長(zhǎng)短的完整信息。

3 水溶性甘草多糖的生物活性

作為傳統(tǒng)中藥材，一直以來(lái)，甘草的藥理作用是研究重點(diǎn)。甘草主要用于治療消化性潰瘍、丙型肝炎、肺部和皮膚疾病。臨床和實(shí)驗(yàn)還證明甘草具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)和保肝等藥理作用［39］。甘草中最主要的藥理活性成分是甘草皂苷(主要包括甘草酸和糖苷配基甘草次酸)和黃酮類化合物。但是越來(lái)越多的研究證明，多糖具有復(fù)雜的多方面的生理活性和功能，特別是對(duì)于機(jī)體免疫功能的作用。甘草中的多糖也受到了越來(lái)越多的關(guān)注。甘草多糖已被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗粘附等生理活性［40，41］。

3.1 水溶性甘草多糖的免疫調(diào)節(jié)活性

甘草多糖對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用主要是激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，具體表現(xiàn)為促進(jìn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的成熟、分化和繁殖，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，提高機(jī)體血清中的抗體水平，活化網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和補(bǔ)體［29，30，40］。

甘草多糖對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用的研究一般要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)方法來(lái)進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定免疫系統(tǒng)中具有免疫活性的某種因子的含量指標(biāo)或者起免疫作用的細(xì)胞的活性來(lái)測(cè)定。Tomoda等［29，31］選取雄性小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，將提取純化的甘草多糖用于碳廓清實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，甘草多糖具有強(qiáng)化網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的活性。Hong等［40］選取昆明系小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，研究了通過(guò)水提醇沉方法獲得的水溶性甘草多糖對(duì)高脂飲食小鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖和血清中抗體水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，喂食了甘草多糖的試驗(yàn)組高脂飲食小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值指數(shù)顯著增加，血清中各種抗體的水平也明顯提高。Cheng等［30，42］研究了甘草多糖對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)甘草多糖能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的胞飲活性并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多的NO和超氧陰離子()，從而增加巨噬細(xì)胞的免疫功能，甘草多糖還能夠促進(jìn)酸性磷酸酶、腺苷三磷酸酶、酸性非特異性酯酶和琥珀酸脫氫酶的產(chǎn)生，同時(shí)也誘導(dǎo)了溶解酵素和超氧化物歧化酶的活性。He等［43］通過(guò)研究甘草多糖對(duì)于患有癌癥的小鼠體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th1/Th2類細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)甘草多糖能夠降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，降低Foxp3在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的表達(dá)，提高小鼠血清中Th1/Th2類細(xì)胞因子比例，從而可能部分抑制腫瘤的生長(zhǎng)。Li等［44］發(fā)現(xiàn)甘草多糖能夠誘導(dǎo)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。

甘草多糖的免疫調(diào)節(jié)作用雖然不能直接作用于腫瘤細(xì)胞，但是通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的成熟、分化和繁殖，同時(shí)活化網(wǎng)上內(nèi)皮系統(tǒng)和補(bǔ)體，促進(jìn)各種細(xì)胞因子的生成，從而起到一定的抗腫瘤作用［45］。王岳五等［46］研究表明，甘草多糖作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可以影響機(jī)體的免疫功能，從而起到抗病毒的作用。他們研究了水溶性甘草多糖對(duì)牛艾滋病病毒(BIV)、腺病毒Ⅲ(AdVⅢ)和柯薩奇病毒(CBV3)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)甘草多糖對(duì)3種病毒均有較為明顯的拮抗作用。

3.2 水溶性甘草多糖的抗氧化活性

許多發(fā)生在人體內(nèi)的生理學(xué)和生化過(guò)程中都可能產(chǎn)生以氧為中心的自由基和其他活性氧。過(guò)多的自由基會(huì)對(duì)人體內(nèi)的生物大分子(如脂肪、蛋白質(zhì)、DNA)造成氧化性損傷，最終導(dǎo)致一些慢性疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、糖尿病和其他退行性疾病)的發(fā)生［47］。甘草中的黃酮類化合物已被證實(shí)具有一定的抗氧化活性［48］，一些研究同樣表明甘草多糖也具有抗氧化活性。甘草多糖的抗氧化活性主要通過(guò)兩方面來(lái)體現(xiàn)，一是通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活性來(lái)減小氧化應(yīng)激，二是甘草多糖對(duì)自由基的清除作用［40］。還有研究表明，甘草多糖溶液對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基具有較好的清除作用［49-50］。

隨著對(duì)甘草多糖研究的不斷深入，甘草多糖除了上述的活性外，還被證實(shí)有其他的的活性。如Tomoda等［33］從甘草多糖中分離出一種含阿拉伯糖-3，6-半乳聚糖型的酸性多糖，發(fā)現(xiàn)它具有抗補(bǔ)體活性、堿性磷酸酶誘導(dǎo)活性和增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)活性。Wittschier等［51］發(fā)現(xiàn)1 mg/mL的甘草提取液即能夠有效地抑制幽門螺桿菌對(duì)人體胃粘膜的粘附，而這一性質(zhì)與提取液中的多糖成分相關(guān)，其中純化后的一種酸性多糖組分是主要的活性成分。此外，還有報(bào)道甘草粗多糖對(duì)牙齦卟啉單胞菌具有強(qiáng)烈的抗粘附作用［52］，對(duì)小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用［53］。

4 結(jié)束語(yǔ)

盡管甘草使用歷史悠久、應(yīng)用廣泛，其中小分子活性物質(zhì)的研究取得了一定進(jìn)展，甘草多糖本身的生物活性得到了一定揭示，但相比其它多糖，甘草多糖的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)均顯得嚴(yán)重不足，目前的研究狀況仍處于初級(jí)階段。甘草中的多糖種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，要得到均一的組分、獲得明晰的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)都具有很大挑戰(zhàn)性。在分離提純、結(jié)構(gòu)分析和生物活性研究上要有別于小分子，體現(xiàn)大分子的研究特征。目前對(duì)甘草多糖的研究還限于水溶性的，對(duì)于其結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道主要還集中于單糖單元的類別、組成比例以及糖苷鍵的連接方式上。即使在這些方面，完整準(zhǔn)確的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息還遠(yuǎn)不完備。作為多糖大分子常常體現(xiàn)出的、與其物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性密切相關(guān)的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象和構(gòu)象變化、可能的聚集體形態(tài)等也鮮有報(bào)道。甚至對(duì)于大分子而言，一些重要的基本分子結(jié)構(gòu)參數(shù)如分子量及分子量分布、取代度及取代度分布、分子尺寸等研究亦未見(jiàn)開(kāi)展。重要的如溶液性質(zhì)、分子間相互作用、與蛋白質(zhì)的連接方式，以及其本身的功能化和改性等研究尚屬空白?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)以及高級(jí)結(jié)構(gòu)的不明晰也從根本上影響了對(duì)于甘草多糖的藥理和生物活性的認(rèn)知，這也直接導(dǎo)致甘草多糖構(gòu)效關(guān)系不明晰。此外，高效的工業(yè)化分離純化制備技術(shù)尚缺乏，這也影響了甘草多糖應(yīng)用的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

上述一直阻礙甘草多糖結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究深入發(fā)展的瓶頸問(wèn)題亟待克服?，F(xiàn)有研究表明，水溶性甘草多糖是成分多種、分子結(jié)構(gòu)高度支化、連接有蛋白質(zhì)成分的雜多糖。與之類似的植物多糖阿拉伯膠和果膠等或可在分離純化、結(jié)構(gòu)表征和生物活性研究方面提供有益借鑒。水溶性甘草多糖已被揭示出具有多方面的生物活性，詳細(xì)的結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)象分析成為進(jìn)一步闡明構(gòu)效關(guān)系的關(guān)鍵。相信隨著研究的深入，甘草多糖多層次結(jié)構(gòu)信息會(huì)被深入了解，藉此也會(huì)促進(jìn)人們對(duì)其生物活性的本質(zhì)認(rèn)識(shí)。

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