周 艷，阮 征,*，黃小流，李 玲，劉文群，溫艷梅，米書梅，吳 信,3，印遇龍,3

(1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031；3.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活方式的改變，居民的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，肥胖、糖尿病、高血脂、高血壓等系列代謝紊亂的發(fā)生率越來越高。近年，越來越多的研究顯示腸道在代謝綜合癥的發(fā)展過程中起著重要的作用[1-2]，其中腸道炎癥的發(fā)生要早于肥胖和胰島素耐受[3]，被認為是引起肥胖和胰島素耐受的起始因素[4]。炎癥性腸病(inf lammation bowel disease，IBD)是一種病因不明、反復發(fā)作的腸道慢性炎癥，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎((ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，在西方國家較為常見，其發(fā)病率達千分之一二[5]，同時在我國越來越多的人遭受IBD的困擾[6]。該病主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉以及便血，可發(fā)生于任何年齡階段，病程時間長，甚至有發(fā)生癌變的可能性，其治療缺乏特異性方法[7]。

藥物控制仍是緩解/治療結(jié)腸炎的主要途徑，然而由于藥效的局限性，及該病反復發(fā)作性，使很多患者面臨著終身服藥的困境。柳氮磺胺吡啶(SASP)是目前治療結(jié)腸炎的首選藥物之一，它在腸道菌群偶氮還原酶的作用下分解成5-氨基水楊酸(5-ASA)和磺胺吡啶(SP)，5-ASA是主要的活性成分，而SP是產(chǎn)生副作用的主要物質(zhì)[8]。研究顯示SASP的副作用與劑量呈正相關(guān)，能引起約30%患者不能耐受[9]，當服用劑量較大時，可能引起慢性肝、腎功能衰竭[10]。因此，尋找安全有效途徑緩解腸道慢性炎癥，不僅能提高IBD患者的健康狀況，而且可預防慢性綜合征的發(fā)生，提高生活質(zhì)量。

圖1 低聚乳果糖的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of lactosucrose

通過天然活性物質(zhì)調(diào)控腸道炎癥水平是一種的重要途徑。益生元以其良好的腸道微生態(tài)和免疫調(diào)節(jié)作用日益受到重視，先后有實驗證明菊粉[11]、低聚半乳糖[12]、低聚果糖[13]在腸道炎癥的治療/改善中取得了顯著效果。低聚乳果糖(lactosucrose，LS)是一種由蔗糖和乳糖通過糖苷酶合成的功能性三糖，其結(jié)構(gòu)從一側(cè)看為乳糖接上一個果糖基[14](圖1)。研究表明LS能促進腸道雙歧桿菌和乳酸菌的增殖，刺激丁酸的產(chǎn)生[15]，同時還具有免疫調(diào)節(jié)作用：Taniguchi等[16]研究發(fā)現(xiàn)LS能抑制小鼠分泌IgE，促進脾細胞分泌抑炎因子白細胞介素10(IL-10)，Hino等[17]用LS飼喂BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)LS能促進派伊爾節(jié)分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1和白細胞介素6(IL-6)。IL-10和IL-6是Th2型細胞因子，同時有研究顯示Th1/Th2分化失衡是引起自身免疫疾病(如IBD)的重要因素[18]。綜上，LS可能通過促進Th2型細胞因子分泌調(diào)節(jié)腸炎大鼠Th1/Th2的平衡，從而達到緩解炎癥的目的。

本實驗以TNBS誘導的IBD模型大鼠為研究對象，通過檢測其對大鼠血漿炎癥介質(zhì)和Th1/Th2型細胞因子的影響，來探討LS緩解慢性腸道炎癥可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

5%三硝基苯磺酸(TNBS) 美國Sigma公司；柳氮磺胺吡啶(SASP) 北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司；LS為實驗室自制；堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒 南京建成生物生物工程研究所；IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測試劑盒 上海鑫樂生物科技有限公司。

5418冷凍離心機 德國艾本德股份公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 動物

SD雌性大鼠，SPF級，體質(zhì)量(200±20)g，4～5周齡，購自上海西普樂-必凱實驗動物有限公司，室溫條件下常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 低聚乳果糖的制備

以蔗糖和乳糖為底物，利用β-呋喃果糖苷酶的酶液合成低聚乳果糖[19]。蔗糖和乳糖以質(zhì)量比1:1混合，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度均為0.20g/mL，底物與酶液體積比為1:1，在pH7.0、溫度35℃、反應22.77h，得產(chǎn)物低聚乳果糖，純化，通過HPLC-ELSD法對低聚乳果糖含量進行測定。低聚乳果糖含量為55%。

1.3.2 結(jié)腸炎模型的建立及處理

采用TNBS灌腸法制作大鼠UC模型[20]。大鼠適應性喂養(yǎng)3d后，取SD大鼠32只，分為正常組、模型組、LS組、SASP組，每組8只。造模前禁食24h，大鼠用質(zhì)量濃度為0.01g/mL的戊巴比妥鈉麻醉，用灌胃針頭輕輕從肛門插入，深度約為8cm，正常組大鼠按100mg/kg(以體質(zhì)量計)灌入蒸餾水，模型組、LS組、SASP組按TNBS劑量為100mg/kg(以大鼠體質(zhì)量計)，推入TNBS溶液，捏緊肛提尾倒立30s后平放，放回籠中自然蘇醒，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

正常組和模型組每只大鼠每天分別灌胃生理鹽水2mL，LS組每只每天灌胃含LS的生理鹽水溶液2mL(LS劑量為250mg/(kg·d))，SASP組每只每天灌胃含SASP的生理鹽水溶液2mL(SASP劑量為250mg/(kg·d))，自由飲水，連續(xù)飼養(yǎng)21d。

1.3.3 血漿的采集

至第21天，各組大鼠禁食24h后，用斷頭法處死大鼠，取血，加入肝素鈉抗凝，于－80℃超低溫冰箱保藏。

1.3.4 ALP、LDH和iNOS活力的檢測

ALP、LDH、iNOS的活力的檢測嚴格按照試劑盒說明書檢測。

1.3.5 血漿細胞因子含量的檢測

血漿IL-4、IL-10和IFN-γ的含量采用ELISA法檢測，按試劑盒說明書進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚乳果糖對TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠體質(zhì)量、采食量的影響

表1 低聚乳果糖對結(jié)腸炎大鼠體質(zhì)量、采食量的影響(±s，n=8)Table 1 Effect of lactosucrose on body weight and food intake(±s，n=8)

表1 低聚乳果糖對結(jié)腸炎大鼠體質(zhì)量、采食量的影響(±s，n=8)Table 1 Effect of lactosucrose on body weight and food intake(±s，n=8)

注：同列小寫字母不同表示差異顯著(P＜0.05)，同列大寫字母不同表示差異極顯著(P＜0.01)。下同。

組別 初始體質(zhì)量/g 末體質(zhì)量/g 采食量/g正常組 231.00±4.83 257.76±16.04b 933.66±45.28b模型組 229.92±16.27 235.00±9.53a 790.21±122.45a LS組 229.71±12.29 250.57±14.44b 862.38±46.82ab SASP組 229.35±11.71 251.00±11.29b 940.34±87.93b

前人研究[21]結(jié)果顯示，IBD容易引起機體體質(zhì)量的降低和采食量的下降。由表1可知，和正常組大鼠相比，TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠的體質(zhì)量和采食量顯著降低(P＜0.05)；通過LS或SASP干預后，大鼠的體質(zhì)量顯著增加(P＜0.05)，且與正常大鼠的體質(zhì)量無顯著差異性；LS干預后腸炎大鼠的采食量與正常組和模型組相比均無差異顯著性。這一結(jié)果說明LS在緩解TNBS誘導的腸道炎癥具有一定的緩解作用。

2.2 低聚乳果糖對TNBS誘導的結(jié)腸炎血漿LDH、ALP和iNOS活力的影響

表2 低聚乳果糖對結(jié)腸炎大鼠血漿LDH、ALP和iNOS活力的影響(±s，n=8)Table 2 Effect of lactosucrose on the activities of LDH, ALP and iNOS(±s，n=8)

表2 低聚乳果糖對結(jié)腸炎大鼠血漿LDH、ALP和iNOS活力的影響(±s，n=8)Table 2 Effect of lactosucrose on the activities of LDH, ALP and iNOS(±s，n=8)

組別 ALP活力/(U/L) LDH活力/(U/L)iNOS活力/(U/mL)正常組 139.67±34.60B 427.67±53.17a 4.57±2.13a模型組 95.80±10.28A 544.75±31.92b 11.05±1.13c LS組 147.83±19.71B 518.43±61.23ab 7.25 ±1.20b SASP組 132.20±18.89B 529.57±98.41ab 7.34±2.79b

由表2可知，TNBS造模后，血漿ALP的活力降低了31.4%，和正常組相比具有極顯著差異性(P＜0.01)，LDH和iNOS的活力顯著增加(P＜0.05)，其中iNOS的活力和正常組相比增加了141.8%。經(jīng)過LS或SASP干預后，極顯著增加了血漿ALP的活力(P＜0.01)，且恢復到正常水平；iNOS的活力顯著降低(P＜0.05)；LDH的活力與正常組和模型組相比均無差異顯著性。LS組與SASP組相比，無差異顯著性。LS干預后對血漿中與炎癥相關(guān)的介質(zhì)的影響的結(jié)果，揭示LS能降低大鼠血漿的炎癥水平。

2.3 低聚乳果糖對TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠血漿細胞因子含量的影響

表3 低聚乳果糖對結(jié)腸炎大鼠血漿IL-4、IFN-γ和IL-10含量的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of lactosucrose on the contents of IL-4, IFN-γ and IL-10(±s，n=8)

表3 低聚乳果糖對結(jié)腸炎大鼠血漿IL-4、IFN-γ和IL-10含量的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of lactosucrose on the contents of IL-4, IFN-γ and IL-10(±s，n=8)

組別 IL-4 含量/(pg/mL) IFN-γ 含量/(pg/mL)IL-10含量/(pg/mL) IFN-γ/IL-4比值正常組 183.92±19.89C 1050.22±47.91A 48.20±5.12b 6.60±1.20a模型組 130.45±17.75A 1368.48±117.55B 37.33±3.57a 11.29±0.90c LS組 165.38±9.06bBC 1185.87±189.65AB 45.96±7.86b 7.12±1.19ab SASP組 149.60±18.69AB 1202.83±146.59AB 48.92±4.91b 8.28±0.54b

由表3可知，和正常組相比，TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠，顯著降低了血漿IL-4(P＜0.01)和IL-10(P＜0.05)的含量，顯著增加了IFN-γ的含量(P＜0.01)以及IFN-γ/IL-4比值(P＜0.05)，其中IFN-γ/IL-4比值增加了71.1%。該模型的結(jié)腸炎大鼠用LS膳食干預后，極顯著地促進了IL-4含量(P＜0.01)的產(chǎn)生，且與正常組相比無顯著差異；顯著增加了IL-10的含量(P＜0.05)；顯著降低了IFN-γ/IL-4比值(P＜0.05)；IFN-γ的含量和模型組相比有所降低，但無差異顯著性。LS組和SASP相比，在促進IL-4產(chǎn)生和降低IFN-γ/IL-4比值上，LS甚至優(yōu)于SASP。以上結(jié)果顯示，LS能調(diào)節(jié)腸炎大鼠血漿免疫水平。

3 討 論

目前關(guān)于低聚糖緩解IBD的研究主要集中在局部腸道組織。Videla等[11]研究結(jié)果顯示菊粉能顯著降低DSS誘導的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜髓過氧化物酶的活力，促進乳酸菌的增殖。Camuesco等[12]研究結(jié)果顯示乳果糖顯著降低TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸TNF-α含量，iNOS蛋白表達，提高谷胱甘肽過氧化物酶的活力。本實驗組的前期實驗結(jié)果顯示低聚乳果糖促進盲腸丁酸的產(chǎn)生[22]。

近年研究發(fā)現(xiàn)IBD患者或動物模型均存在不同程度的腸道屏障功能異常，如腸道通透性增加[23]。腸道通透性的增加使得腸腔中內(nèi)毒素(脂多糖)進入血液循環(huán)系統(tǒng)，引起全身性的炎癥反應，導致全身性的低水平的慢性炎癥[24]，因此我們推測IBD的發(fā)生對血液炎癥水平造成影響。本實驗主要通過檢測低聚乳果糖干預TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠對血漿炎癥水平及免疫細胞因子的影響，探討其可能的作用機制。

本實驗結(jié)果表明LS能減輕血漿的炎癥水平。LDH是一種參與糖酵解的重要酶，當機體組織器官發(fā)生損傷時，會引起血液中LDH的改變，常用來作為細胞或組織損傷的監(jiān)測指標。TNBS造模后，模型組LDH的活力顯著高于正常組，而LS干預后乳酸脫氫酶的含量有所降低，但與模型組和正常組均無顯著差異性。說明LS在一定程度上降低了細胞損傷。ALP能非特異性的水解磷酸單酯鍵，其能水解脂多糖的1-磷酸鍵，使其轉(zhuǎn)變?yōu)閱瘟滋珹，單磷酞脂A不與膜受體結(jié)合，不能刺激機體炎癥反應[25]，因此ALP能降低脂多糖引起的炎癥反應。在正常生理情況下，iNOS表達較低，當內(nèi)毒素含量增加時iNOS被誘導激活，產(chǎn)生高濃度的NO，使炎癥水平加劇[26]，同時Th1細胞的活化也能刺激iNOS產(chǎn)生[27]。由于ALP能抑制內(nèi)毒素的毒性，因此ALP活力的增加以及抑制Th1細胞活化能抑制iNOS的活力，緩解炎癥水平。實驗結(jié)果顯示，TNBS誘導后血中ALP活力極顯著降低，iNOS的活力顯著升高，說明TNBS造成了血漿炎癥的發(fā)生。LS干預后，和模型組相比，LS極顯著提高了ALP的活力，顯著降低了iNOS的活力，說明LS能降低機體炎癥水平。綜上，LS在一定程度上緩解了TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠血漿炎癥水平。

Th1/Th2細胞分化失衡在IBD發(fā)病機制中起著重要作用[18]。Th1細胞能有效的刺激細胞免疫反應，主要分泌的細胞因子有IFN-γ；Th2細胞主要是刺激體液免疫反應，其分泌的細胞因子主要有IL-4、IL-10等[28]。研究顯示，Th1型細胞誘導iNOS的產(chǎn)生。LS干預后iNOS活力的降低，可能與Th1細胞受到抑制有關(guān)。LS的前期研究結(jié)果顯示，LS能促進Th2型細胞因子IL-10、IL-6的產(chǎn)生，因此LS能刺激Th2型細胞的活化，而Th2型細胞在功能上與Th1型細胞相互拮抗，推測LS對血漿炎癥水平的緩解可能與Th1/Th2平衡有關(guān)。

TNBS誘導的結(jié)腸炎模型，其病變部位IFN-γ和IL-12的含量明顯升高，而用抗IL-12抗體治療后可明顯減輕炎癥，說明該模型是由IL-12驅(qū)動的Thl反應占優(yōu)勢的炎癥[29]。本實驗的結(jié)果顯示TNBS造模21d后，與正常組相比，模型組顯著增加了Th1型細胞因子IFN-γ的含量以及IFN-γ/IL-4比值，而Th2型細胞因子IL-4和IL-10的含量顯著降低，說明TNBS結(jié)腸炎大鼠Th1/Th2平衡向Th1方向移動，Th1型免疫反應占優(yōu)勢，與前人研究結(jié)果一致。LS干預后，IL-4和IL-10顯著增加，同時IFN-γ/IL-4的比值顯著降低且與正常組無顯著差異性，在一定程度上降低IFN-γ的含量，這一結(jié)果說明LS對Th2型細胞因子的作用優(yōu)于Th1型細胞因子，結(jié)腸炎大鼠體內(nèi)Th1型免疫反應得到抑制，Th1/Th2重新得到平衡。

本實驗結(jié)果表明LS通過促進Th2型細胞因子的分泌，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡，從而改善結(jié)腸炎大鼠炎癥水平。與SASP相比，LS顯示出了類似的效果，甚至在促進IL-4的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-4比值，LS稍優(yōu)于SASP。

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