劉青，李揚，何芳，張清靖，倪健，邵森林

(1.大連海洋大學遼寧省水生生物學重點實驗室，遼寧大連116023;2.北京水產(chǎn)科學研究所，北京100068;3.新疆賽湖漁業(yè)科技開發(fā)有限公司，新疆博樂 833400）

印楝素對大型溞生存、生長和繁殖的毒性效應(yīng)

劉青1，李揚1，何芳1，張清靖2，倪健3，邵森林1

(1.大連海洋大學遼寧省水生生物學重點實驗室，遼寧大連116023;2.北京水產(chǎn)科學研究所，北京100068;3.新疆賽湖漁業(yè)科技開發(fā)有限公司，新疆博樂 833400）

通過急性、慢性毒性試驗，研究了質(zhì)量分數(shù)為0.32%的印楝素乳油對大型溞Daphnia magna生存、生長和繁殖的影響。急性毒性試驗結(jié)果表明:印楝素對大型溞24 h和48 h的半致死濃度LC50分別為39、17 μg/L，安全濃度為1.12 μg/L，屬于劇毒物質(zhì)。慢性毒性試驗結(jié)果表明:在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著印楝素濃度的增加，大型溞的內(nèi)稟增長率(rm）、產(chǎn)幼次數(shù)、總繁殖量、平均世代周期(T）、凈生殖率(R0）和存活時間均呈現(xiàn)降低趨勢;低濃度組 (0.432、0.768、1.120 μg/L）大型溞的rm與對照組 (空白對照和丙酮對照）差異不明顯(P＞0.05），當印楝素濃度升高至1.340、2.400 μg/L時，大型溞的rm逐漸下降，從0.347 6 d－1降至最低值0.306 3 d－1;而最高印楝素濃度組 (2.400 μg/L）大型溞的存活時間、R0、T、產(chǎn)幼次數(shù)和總繁殖量均為最低，分別為13.60 d、24.696 1、11.439 9 d、2.47次、26.87個。本研究表明，高濃度印楝素顯著縮短了大型溞的存活時間，降低了凈生殖率R0、平均世代時間T、產(chǎn)幼次數(shù)和總繁殖量。關(guān)鍵詞:印楝素;大型溞;毒性;內(nèi)稟增長率;存活;繁殖

印楝素是印楝Azadirachta indica種仁中所含的次生代謝產(chǎn)物，屬于四環(huán)三萜類物質(zhì)，在結(jié)構(gòu)上類似于昆蟲的蛻皮激素。在昆蟲防治上，主要通過破壞昆蟲口器的化學感受器使昆蟲產(chǎn)生拒食作用，擾亂昆蟲內(nèi)分泌激素的平衡，進而影響昆蟲的生長發(fā)育和繁殖［1－2］。印楝素對非靶標的魚類、鳥類、哺乳動物具有低毒、易分解、無殘留等特性，是理想的植物源殺蟲劑［3－4］，現(xiàn)已在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和森林病蟲害的防治［5－6］。在大量使用的過程中，印楝素會隨著雨水沖刷、人工噴灑等過程進入到天然水環(huán)境［7］，進而通過食物鏈的富集進入生物體內(nèi)，并對低等水生生物產(chǎn)生一定的影響。因此，評價印楝素對低等水生生物的影響具有重要意義。

大型溞Daphnia magna在水生態(tài)系統(tǒng)中處于重要位置，具有生活周期短、繁殖快、易于培養(yǎng)、對毒物敏感、經(jīng)濟實惠、使用簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于各種有毒有害物質(zhì)的毒性評價中［8－9］。目前關(guān)于印楝素對低等水生生物影響的報道很少，僅見Kreutzweiser［7］報道了印楝素對幾種底棲動物的毒性以及聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織 (FAO）報告中公布了印楝素對幾種水生無脊椎動物的毒性［10］，而國內(nèi)關(guān)于印楝素對低等水生生物影響的研究尚未見報道。本研究中，作者以大型溞為試驗動物，通過急性、慢性毒性試驗，研究了質(zhì)量分數(shù)為0.32%的印楝素乳油對大型溞生存、生長和繁殖的影響，旨在對印楝素的安全性評價提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大型溞由大連海洋大學水生生物實驗室提供，從人工氣候箱 (RTOP－500D）中挑選健康個體，用同一母體繁殖的后代進行克隆培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)達到試驗所需幼溞數(shù)量。大型溞的餌料為四尾柵藻Scenedesmus quadricanda，由大連海洋大學水生生物實驗室提供。

試驗用0.32%(質(zhì)量分數(shù)，下同）印楝素乳油由沈陽東大迪克化工藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，采用丙酮助溶。使用時先配制濃度為1 000 mg/L的母液，再按試驗濃度逐級稀釋，母液現(xiàn)配現(xiàn)用。

試驗用水為曝氣除氯24 h以上的自來水，pH為8.7，溶解氧為6～8mg/L，試驗容器均用體積分數(shù)為4%的硝酸浸泡24 h后使用。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 采用靜態(tài)試驗方法，在人工氣候箱中進行。設(shè)置1個空白對照組和1個丙酮對照組 (丙酮含量為18 mg/L），并根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，按等對數(shù)間距分別設(shè)置5個印楝素濃度水平:24 h急性毒性試驗中濃度設(shè)置為18、24、32、43、58 μg/L，48 h急性毒性試驗中濃度設(shè)置為10、13、18、24、32 μg/L，每個濃度梯度設(shè)3個平行。試驗容器為100 mL的燒杯，每個燒杯中放入80 mL試驗溶液和20只出生6～24 h的大型溞幼溞。以受試溞心臟停止跳動為死亡標志，判斷方法詳見《水生生物毒性試驗方法》［11］。應(yīng)用SPSS 16.0軟件中的Probit命令對死亡率進行計算，得到印楝素對大型溞的24 h LC50和48 h LC50及其相應(yīng)的95%置信區(qū)間，并按照下式計算安全濃度 (Sc）［12］:

1.2.2 慢性毒性試驗 以24 h和48 h的LC50計算得出的印楝素對大型溞安全濃度 (1.12 μg/L）為基礎(chǔ)，設(shè)置 5個印楝素濃度水平 (0.432、0.768、1.120、1.340、2.400 μg/L），同時設(shè)置空白對照和丙酮對照組，每個濃度梯度設(shè)15個平行。試驗容器為50 mL的玻璃瓶，每瓶放入40 mL試驗溶液和1只出生6～24 h的幼溞。試驗在人工氣候箱中進行，溫度為 (23±1）℃，光周期為12L∶12D，濕度為50%。每24 h更換1次試驗溶液，試驗期間用新鮮四尾柵藻投喂，投餌密度為2.0×105～3.0×105個/mL。同時取出新生幼溞，并記錄母溞第1次產(chǎn)幼時間、第1次產(chǎn)幼數(shù)、產(chǎn)幼總數(shù)、總胎數(shù)和死亡數(shù)，時間持續(xù)到所有受試個體全部死亡為止，最后測量母溞的體長。

大型溞的內(nèi)稟增長率 (rm）采用文獻 ［13］中的Euler方程計算:rm的精確值是在粗略計算的基礎(chǔ)上采用逐步逼近法得出。

大型溞的凈生殖率 (R0）、平均世代時間 (T）和周限增長率 (λ）根據(jù)下式進行計算:

其中:x為日齡;lx為第x天大型溞的存活率;mx為每只母溞在第x天的產(chǎn)幼數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進行處理，采用SPSS 16.0進行單因素方差分析和Duncan多重比較。顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素對大型溞的急性毒性

從表1可見，急性毒性試驗中，大型溞的死亡率隨著印楝素濃度的增加而升高。24 h急性毒性試驗中，除兩個較低濃度組 (18 μg/L和24 μg/L）外，其他3個濃度組大型溞的死亡數(shù)與對照組均有顯著性差異 (P＜0.05）;48 h急性毒性試驗中，各濃度組與對照組均有顯著性差異 (P＜0.05）。經(jīng)計算得到印楝素對大型溞的24 h LC50和48 h LC50分別為 39 μg/L 和 17 μg/L，95% 置信區(qū)間分 別為34 ～46 μg/L 和15 ～20 μg/L，印楝素對大型溞的安全濃度為1.12 μg/L。

表1 印楝素對大型溞的急性毒性試驗結(jié)果Tab.1 Acute toxicity of azadirachtin to water fleas Daphnia magna

2.2 印楝素對大型溞的慢性毒性

從表2可見:當印楝素濃度為0.432 μg/L時，大型溞的存活時間與對照組沒有顯著性差異 (P＞0.05）;當濃度升高到0.768 μg/L時，對大型溞的存活時間產(chǎn)生明顯影響 (P＜0.05），且濃度越高大型溞的存活時間越短。

印楝素對大型溞的繁殖有明顯影響，雖然各試驗組間母溞的第1次產(chǎn)幼數(shù)無顯著性差異 (P＞0.05），但母溞的第1次產(chǎn)幼時間隨印楝素濃度的變化而變化。當印楝素濃度大于或等于1.120 μg/L時，母溞的第1次產(chǎn)幼時間比對照組顯著提前 (P＜0.05）。母溞的產(chǎn)幼總數(shù)和產(chǎn)幼總胎數(shù)均隨藥物濃度的升高而減少，除最低濃度 (0.432 μg/L）組外，其他濃度組中母溞的產(chǎn)幼總胎數(shù)和產(chǎn)幼總數(shù)均比對照組顯著降低 (P＜0.05）;當印楝素濃度為2.400 μg/L時，母溞產(chǎn)幼溞總數(shù)僅為26.87個，遠低于空白對照組 (249.93個）和丙酮對照組 (203.06個），產(chǎn)幼胎數(shù)也僅有2.47次，遠低于空白對照組 (18.71次）和丙酮對照組(18.55次）。

印楝素對大型溞生長的影響不明顯，只有當濃度增大到2.400 μg/L時，才對大型溞的體長產(chǎn)生顯著影響 (P＜0.05）。

表2 不同濃度的印楝素對大型溞存活、生長和繁殖的影響Tab.2 Effect of azadirachtin on growth and reproduction of water fleas Daphnia magna

從圖1可見:試驗初期 (10 d內(nèi)），各濃度組中大型溞的存活數(shù)與對照組相差不大 (P＞0.05）;隨著試驗時間的延長，大型溞的存活數(shù)隨著印楝素濃度的升高有明顯變化。最低濃度組 (0.432 μg/L）大型溞的存活數(shù)隨時間下降的變化趨勢與對照組始終相差不明顯 (P＞0.05），而最高濃度組(2.400 μg/L）溞的存活數(shù)隨試驗時間的延長明顯急劇下降。即印楝素濃度越高，大型溞的存活數(shù)隨時間下降越快。

圖1 各組大型溞的存活數(shù)隨時間的變化Fig.1 Changes in survivorship of Daphnia magna in different experimental groups over time

從表3可見:除高濃度組 (2.400 μg/L）大型溞的內(nèi)稟增長率 (rm）和周限增長率 (λ）較低外，其他各藥物濃度組大型溞的rm和λ與對照組變化不大;印楝素濃度對大型溞的平均世代時間(T）和凈生殖率 (R0）影響十分明顯，均隨著印楝素濃度的增加而降低。當印楝素濃度為0.432 μg/L時，大型溞的T和R0分別為28.723 9 d和226.489 7，與對照組大型溞的T和R0的比值分別為1.004和0.922 3;但當濃度增加到2.400 μg/L時，大型溞的 T和 R0分別為 11.439 9d和24.696 1，與對照組大型溞的T和R0的比值卻分別降為0.400 0和0.100 6。

3 討論

3.1 印楝素對水生生物的毒性

水生生物毒性試驗是預(yù)測化學物質(zhì)進入水生態(tài)系統(tǒng)后可能產(chǎn)生效應(yīng)的方法之一，參考一些國家的分級標準中國將毒物分為劇毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5個級別［12］。對溞類而言，當48 h LC50＜0.1 mg/L時屬于劇毒物質(zhì)。本試驗中0.32%印楝素乳油對大型溞的24 h LC50和48 h LC50值分別為0.039 mg/L和 0.017 mg/L，按毒物分級標準，0.32%印楝素乳油對大型溞屬于劇毒物質(zhì)。印楝素對水生生物的影響報道不多見，吳偉等［3］研究了印楝素對斑馬魚Danio rerio的急性毒性，得出印楝素對斑馬魚的48 h LC50和96 h LC50分別為41.9 mg/L和23.3 mg/L，屬中低毒農(nóng)藥。如把 Margosan－O混入水中，鱒的96 h LC50為88 mg/L，翻車魚的 96 h LC50為 37 mg/L［14］，表明 Margosan－O對魚類低毒。Kreutzweiser［7］報道了印楝素對Hydatophylax argus等幾種底棲生物無明顯急性毒性。聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織 (FAO）［10］的報告顯示，印楝素對幾種低等水生生物的影響也較小，對藻類柵藻Scenedesmus subspicatus的72 h EC50為530 mg/L，對大型溞Daphnia magna的48 h EC50為23.63 mg/L。陳小軍等［15］研究表明，印楝素對水生生物無明顯毒性或毒性較小。而本試驗中得到的大型溞毒性試驗數(shù)據(jù)與FAO公布的數(shù)據(jù)相差很大，導致這種結(jié)果的差異有多方面的原因，可能與使用的助溶劑和藥物的產(chǎn)地、季節(jié)、劑型、試驗環(huán)境條件及受試生物的不同品系等有關(guān)。

表3 不同濃度的印楝素對大型溞生命周期的影響Tab.3 Effect of different concentrations of azadirachtin on life cycle of water fleas Daphnia magna

印楝素不溶于水，本試驗中用丙酮作助溶劑，丙酮為微毒或無毒物質(zhì)［16］，符合毒性試驗要求。FAO的數(shù)據(jù)沒有助溶劑類型，對此作者不好判定。

印楝素是印楝種仁中所含的次生代謝產(chǎn)物，為檸檬素類化合物［1－2］。試驗證實，不同地區(qū)的印楝種仁中印楝素含量差別很大，印度、緬甸和泰國的印楝素含量較高，而夏季氣溫高的蘇丹、索馬里、馬里和尼泊爾等國家的印楝素含量較低［17］。

除了不同的地理種源外，不同季節(jié)收獲的印楝種仁中，印楝素的含量也有較大差別。印楝素殺蟲劑中的主要活性成分有印楝素A和印楝素B，通常印楝素B的含量為印楝素A的1/3～1/2［18］。Sidhu等［19］認為，印楝素A是雨季所結(jié)果實種子中的主要代謝物，在雨季含量較高，而干季脅迫明顯有利于印楝素B的合成，在干季所結(jié)果實種子中兩者含量的比例幾乎相等?？梢?，收獲季節(jié)不同，是影響印楝素A和B含量的主要因素。

印楝素A和B的穩(wěn)定性和致毒作用也各不同。二者在甲醇、甲醇+水及直接熱貯中均易降解，且印楝素A降解率高于印楝素B，即印楝素B的穩(wěn)定性高于印楝素A［20］。在活體拒食和生長發(fā)育抑制試驗中，印楝素A的活性顯著高于印楝素B，但對細胞核的影響中，印楝素B的影響顯著高于印楝素A，經(jīng)印楝素B處理后的細胞核破損率更大，破損程度也更嚴重［18］。

印楝素含量及其穩(wěn)定性除受遺傳因素控制外也會因受環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化。印楝素對光敏感，暴露在光下會逐漸失去活性;溫度對印楝素的穩(wěn)定性也有影響，通常需在低于20℃的溫度下貯藏，高溫會加速印楝素的降解;印楝素在中性條件下比較穩(wěn)定，但在堿性和強酸溶液中不穩(wěn)定［17］。

由此可見，作為植物源藥物的印楝素，其產(chǎn)地、出產(chǎn)季節(jié)和保存方式等都是影響藥性的重要因素，會直接導致各試驗結(jié)果的差異。

此外，藥物的不同劑型對藥效也有很大影響。印楝素有多種劑型，目前在美國登記的印楝殺蟲劑產(chǎn)品有:Neem oil 15種、Neem oil rtu 14種、Neem oil tgai 1種、Trilogy xl 4種和Trilogy xl rtu 4種。中國批準登記的印楝素殺蟲劑主要有40%、32.8%、20%、12%和10%印楝原藥及0.3%、0.32%、0.5%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%和2.0%的印楝素單劑等［15］。Abou－Tarboush 等［21］以印楝殺蟲劑Neemix－4.5處理SWR/J鼠，其研究結(jié)果與之前純印楝素對鼠的影響結(jié)果不一致。張欣等［22］研究發(fā)現(xiàn)，脂溶性的乳劑類除草劑丁草胺比粉劑的毒性大得多。本試驗中使用的印楝素屬于脂溶性，這也可能加大了印楝素對大型溞的毒性。當然，不同溶劑、不同產(chǎn)地、不同劑型的印楝素對大型溞的毒性需要進一步試驗證實。

3.2 印楝素對大型溞內(nèi)稟增長率和繁殖的影響

一種生物的內(nèi)稟增長能力決定了該種生物的生育力、壽命和發(fā)育速率，是種群增殖能力的一個重要綜合指標，可以靈敏地反映出環(huán)境對一種群的影響［13］。本試驗中，低濃度組 (0.432、0.768、1.120 μg/L）大型溞的內(nèi)稟增長率與對照組 (空白對照和丙酮對照）差別不大，甚至略有提高，這與一些研究結(jié)果相似。如Chu等［23］研究表明，5 μg/L和50 μg/L的S－烯蟲酯促進了多刺裸腹溞的種群增長。楊冬青等［24］也發(fā)現(xiàn)，低濃度 (0.1 μg/L和1.0 μg/L）的β－六六六對多刺裸腹溞的種群增長也有明顯的促進作用。黃國蘭等［25］發(fā)現(xiàn)，4.0、2.0、1.0 mg/L的DBP對大型溞繁殖有抑制作用，而0.5 mg/L的DBP顯著提高了大型溞的凈生殖率。以上研究均表明，在被低濃度藥物刺激后，溞類等生物受到輕度逆境脅迫，可促使其瞬時增長率增大，以此來抵御外部不良的環(huán)境條件。本試驗中隨著印楝素濃度升高至2.400 μg/L，大型溞內(nèi)稟增長率逐漸下降為最低值0.306 3 d－1。Fernndez 等［26］與 Ferrando 等［27］研究認為，種群內(nèi)稟增長率的降低是殺蟲劑對溞類的慢性毒性所致。

本試驗中，與對照組相比，高濃度組(1.340、2.400 μg/L）大型溞的初次產(chǎn)幼時間早，產(chǎn)幼總數(shù)和產(chǎn)幼次數(shù)少，存活時間短，大型溞的內(nèi)稟增長率、凈生殖率和世代時間均減少。有研究表明，100、1 000 μg/L的β－六六六能顯著縮短多刺裸腹溞的世代時間，且1 000 μg/L的β－六六六還能顯著減小多刺裸腹溞出生時的生命期望值和凈生殖率［24］。Chuah 等［28］研究也表明，0.002 mg/L的硫丹能顯著降低多刺裸腹溞的平均壽命、首次生殖年齡和種群內(nèi)稟增長率。高濃度、亞致死劑量的殺蟲劑使浮游動物母體中毒加深，影響了母體的機能、生存和繁殖，即對浮游動物的種群增長產(chǎn)生抑制作用［29－30］，這已是不爭的事實。

有研究報道，在藥物作用或生存環(huán)境改變的條件下，枝角類能改變生殖方式，產(chǎn)生休眠卵［31－33］。本試驗中，隨著印楝素濃度的增加，產(chǎn)生休眠卵的個體及每個個體產(chǎn)休眠卵的數(shù)量也增加，并且是在沒有雄性個體的情況下由雌體直接產(chǎn)生。這種情況在蚤狀溞種群中出現(xiàn)過，即在沒有雄體時也能進行有性生殖，雌體直接產(chǎn)生卵鞍，并在未受精的情況下孵出幼溞［34－35］。本試驗中，除 0.432 μg/L 濃度組外，其他濃度組的大型溞均有幾次在生殖高峰后產(chǎn)生休眠卵，這可能與印楝素的藥性以及沒有迅速移除幼溞、試驗水體較小有關(guān)，造成母溞一段時間處于劣質(zhì)的環(huán)境中而產(chǎn)生了休眠卵。

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The toxicity of azadirachtin to survival，growth and reproduction of water fleas Daphnia magna

LIU Qing1，LI Yang1，HE Fang1，ZHANG Qing-jing2，NI Jian3，SHAO Sen-lin1
(1.Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China;2.Beijing Fisheries Research Institute，Beijing 100068，China;3.Xinjiang Saihu Fishery Technology Development Co.，Ltd.，Bole 833400，China）

The toxic effects of 0.32%azadirachtin EC on survival，growth and reproduction of water fleas Daphnia magna were studied by acute and chronic toxicity tests.The acute toxicity test showed that azadirachtin as a highly toxic substance had the 24 h LC50of 39 μg/L，48 h LC50of 17 μg/L and the safety concentration of 1.12 μg/L for the water fleas.The Chronic toxicity test revealed that the water fleas showed decrease in intrinsic rate of population increase(rm），number of clutches per female，total offspring per female，generation time(T），net reproductive rate(R0），and survival time with the increasing azadirachtin concentration.There was no significant difference in the rmin the water fleas between the control group and low concentration groups(0.432，0.768 and 1.120 μg/L）(P＞0.05）.The rmwas decreased from 0.347 6 d－1at insecticide concentration of 1.340 to 0.306 3 d－1at insecticide concentration of 2.400 μg/L.The minimal number of clutches per female(2.47 times）and total offspring per female(26.87 ind.），the minimal survival time(13.60 d），the minimal R0(24.696 1），and T(11.439 9 d）were observed at the maximal concentration of 2.400 μg/L.In conclusion，the findings show that high concentrations of azadirachtin leads to short survival time，and T，and to reduce in R0number of clutches per female and total offspring per female significantly.

azadirachtin;Daphnia magna;toxicity;intrinsic rate of population increase;survival;reproduction

Q959.223

A

2095－1388(2013）02－0121－06

2013－02－28

國家大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目 (CAR－46－26）

劉青 (1966－），女，副教授。E－mail:liuqing@dlou.edu.cn