唐東紅，罕圓圓，羅云，王城寬，黃英，畢正生，葉尤松

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118;2.云南省中醫(yī)學(xué)院，昆明 650200)

黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(xanthine dehydrogenase/oxidase，XDH/XO)是一種非特異性需氧脫氫酶，人類的XDH/XO 酶在嘌呤代謝過(guò)程中催化嘌呤代謝的最后兩步，從黃嘌呤和次黃嘌呤形成尿酸代謝產(chǎn)物終產(chǎn)物尿酸，在尿酸的代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，是體內(nèi)核酸代謝中一種非常重要的酶。在生物進(jìn)化過(guò)程中，人類及部分靈長(zhǎng)類體內(nèi)尿酸氧化酶失活［1，2］，尿酸成為嘌呤代謝的終產(chǎn)物，它起到組織免受氧化損傷的作用。

XDH/XO 的分布有物種和組織特異性，狗和小鼠心肌內(nèi)XDH/XO 活性很高，兔和豬心肌內(nèi)XDH/XO 活性很低，在人體及靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)XDH/XO主要分布于肝臟組織，其次為小腸，其余組織例如一些上皮細(xì)胞中的含量不足前兩者含量的3%［3］。研究證實(shí)，高尿酸狀態(tài)下，XO 活性也增加，血尿酸水平增高，24 h 尿酸排泄量相應(yīng)增加，持續(xù)的高尿酸血癥狀態(tài)可引起組織器官發(fā)生相應(yīng)的病變，誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性皮下結(jié)節(jié)、腎結(jié)石等疾病，而且血尿酸水平與高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、脂代謝紊亂、心力衰竭及腦梗死等許多心血管疾病密切相關(guān)，增加心血管疾病和糖尿病死亡率［4-6］，高尿酸血癥和痛風(fēng)為嚴(yán)重危害人類健康的代謝類疾病，從尿酸代謝途徑的各個(gè)環(huán)節(jié)分析，XDH/XO 是尿酸生成過(guò)多的高尿酸血癥的一個(gè)主要發(fā)病原因。目前，XDH/XO 抑制劑是治療高尿酸血癥的主要藥物之一，如別嘌呤醇(Allopurinol)。但該藥物在常規(guī)劑量(300 mg)下藥效的局限性及較大的臨床副作用，在一定程度上限制了別嘌呤醇在治療高尿酸血癥中的應(yīng)用。近年來(lái)，研究者以XDH/XO 為靶點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)了一些活性化合物對(duì)其有一定的抑制作用，例如Jeongmi 等［7］發(fā)現(xiàn)多種中草藥混合提取物含有的多酚類和黃酮類能夠抑制肝臟XO活性，更多的有效的XO 競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑類藥物還有待于進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步開(kāi)展高尿酸血癥致病機(jī)理及開(kāi)發(fā)控制血液尿酸水平的抗高尿酸血癥新藥，建立體內(nèi)XDH/XO mRNA 及XDH/XO 蛋白表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)方法意義重大。

本實(shí)驗(yàn)選取由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心飼養(yǎng)的獼猴的新鮮肝臟組織，進(jìn)行肝組織總RNA 的提取，參照GenBank:U39487.1 人類hXDH/XO 基因編碼序列cDNA 序列作為參考，設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR 對(duì)獼猴XDH/XO 基因進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增后所獲得的基因片段進(jìn)行序列分析及生物信息學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為下一步在獼猴中開(kāi)展高尿酸血癥致病機(jī)理研究，抗高尿酸血癥新藥研發(fā)奠定一定的工作基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1 只雄性普通級(jí)獼猴，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類中心提供［SCXK(滇)2010-0003］，7.6 kg，8 周齡，實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所進(jìn)行［SYXK(滇)2010-0007］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，批準(zhǔn)號(hào)為(2011)-003，同時(shí)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol 試劑(invitrogen 公司)，PrimeScript RT reagent Kit(大連寶生物工程有限公司)，Premix Ex Taq 酶(大連寶生物工程有限公司)，DL2000 DNA marker(大連寶生物科技有限公司)，梯度PCR 儀(Bio-Rad，USA)，SS-325 高壓蒸氣滅菌箱(Tomy，Japan)，PowerPac Basic 電泳儀(Bio-Rad，USA)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)，ND-1000 紫外分光光度計(jì)(DanoDrop，USA)。

1.3 PCR 引物設(shè)計(jì)與合成

引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI 提供的人類XDH/XO 核苷酸序列(U39487.1)，利用Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，擴(kuò)增其CDS 區(qū)域，所設(shè)計(jì)的上游引物為:5'-CCTTTTCTGAATCAGGCAGGAGCCC-3，下游引物為:5'-CAGTCGCGGAGCAGGGACAC-3'，目的片段大小為683 bp，由大連寶生物科技有限公司合成。

1.4 獼猴新鮮肝臟組織的獲得及肝組織總RNA的提取

對(duì)猴號(hào)為030408305 的獼猴進(jìn)行肝臟組織活體穿刺，獲得少量肝組織，約50 mg。將50 mg 新鮮肝臟組織在液氮中碾磨成粉末后，加入0.5 mL Trizol，充分裂解后加0.2 mL 氯仿，劇烈震蕩后置冰上，出現(xiàn)分層后于4℃13 500 r/min離心30 min，轉(zhuǎn)移水相，加等體積預(yù)冷異丙醇，放置－20℃1 h 后，于4℃13 500 r/min離心30 min，離心管底可見(jiàn)RNA沉淀。經(jīng)75%乙醇洗脫后，將RNA 沉淀置于室溫自然干燥，用20 μL DEPC 處理水溶解后，于65℃變性5 min，取0.15 μL 總RNA 提取液于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察28 S 和18 S RNA 條帶亮度，分析RNA 的完整性，ND-1000 紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280nm，分析純度、RNA 濃度。

1.5 RT-PCR

根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。每10 μL 體系中依次加入5 ×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，總RNA(濃度稀釋為500 ng/μL)1 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件為:37℃，45 min，85℃，30 s，4℃，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA 為模板進(jìn)行XDH/XO 基因的PCR 擴(kuò)增:反應(yīng)體系為25 μL。分別加上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)、模板cDNA 5 μL、滅菌去離子水5.5 μL、Premix Ex Tag 12.5 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，93℃變性30 s、65.5℃退火30 s、72℃延伸30 s、33 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠影像分析儀下觀察所擴(kuò)增的目的片段。

1.6 目的片段基因的序列測(cè)定

將RT-PCR 產(chǎn)物送百泰克生物科技公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用ChromasPro 軟件進(jìn)行堿基序列拼接，利用DNAMAN 軟件對(duì)目的基因核苷酸進(jìn)行分析。

1.7 基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

采用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模。利用生物信息學(xué)工具interproscan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對(duì)所獲得的XDH/XO 核苷酸序列進(jìn)行基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 獼猴肝臟組織總RNA 的提取

從獼猴新鮮肝臟組織提取的總RNA 進(jìn)行電泳，結(jié)果可觀察到見(jiàn)28 S、18 S、5 S 三條帶，見(jiàn)圖1，說(shuō)明所提取的總RNA 無(wú)降解，可進(jìn)一步用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所提取的總RNA 樣品經(jīng)Nanodrop-1000 超微量核酸測(cè)定儀測(cè)定，A260/A280nm 值為1.94，介于1.8 ～2.0 之間時(shí)，說(shuō)明純度較高。

圖1 獼猴肝臟組織總RNA 電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA from the liver tissue of rhesus macaque

2.2 獼猴XDH/XO 基因RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

肝組織的RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳，結(jié)果擴(kuò)增出目的條帶，與所設(shè)計(jì)的片段大小一致，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 RT-PCR 電泳結(jié)果Fig.2 Result of electrophoresis of the RT-PCR products

2.3 基因測(cè)序結(jié)果及序列分析

送由上海生物工程有限公司進(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序波峰圖略。序列共測(cè)到683 個(gè)核苷酸，編碼208個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為22 721，包括了1 個(gè)編碼53 個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框(ORF)，見(jiàn)圖3。DNAMAN 對(duì)目的基因核苷酸序列與NCBI 報(bào)道的人類(Homo sapiens，U39487.1)mRNA 核苷酸序列、小鼠Mus musculus(NM0111723.2)、家鼠Rattus norvegicus(NM 017154.4)、野豬Sus scrofa (JN896312.1)XDH/XO 基因mRNA 核苷酸序列同源性進(jìn)行同源性比較分析，見(jiàn)圖4，其中與人類同源性最高，為95.32%，與小鼠、家鼠、野豬同源性分別為84.94%、84.53%、85.94%。圖5 顯示了不同物種XDH/XO 基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

圖3 獼猴XDH/XO 基因片段序列測(cè)定結(jié)果Fig.3 Results of sequencing XDH/XO gene fragments in the rhesus monkey

2.4 SWISS-MODEL 及InterProScan 構(gòu)建XDH/XO 基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域

圖6 顯 示SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建XDH/XO 基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)。圖7 顯 示InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域功能，結(jié)果顯示該段XDH/XO 編碼蛋白含有醛氧化/脫氫酶的鉬喋呤結(jié)合點(diǎn)結(jié)構(gòu)域(Aldehyde oxidase/xanthine dehydrogenase molybdopterin binding domain)、黃嘌呤脫氫酶結(jié)構(gòu)域(Xanthine dehydrogenase domain)。

3 討論

目前研究者已對(duì)人、鼠、果蠅、蚊、貓等多種動(dòng)物的XDH/XO 基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究及染色體定位［8-12］，繪制出人類XDH/XO(hXDH/XO)基因在位于2p22的一個(gè)單基因座上，有報(bào)道顯示hXDH/XO 基因有三種不同的cDNA 序列［13］，小鼠的XDH/XO(mXDH/XO)基因在位于17 號(hào)染色體短臂上，與昆蟲的XDH/XO(mXDH/XO)基因結(jié)構(gòu)有很大差異。

研究已證實(shí)［3］，哺乳動(dòng)物體內(nèi)該酶主要利用NAD+作為電子受體以黃嘌呤脫氫酶的形式存在，它是XO 的前體，相對(duì)無(wú)活性，但當(dāng)組織處于缺血低氧等病理情況下，就可以轉(zhuǎn)化為該酶的另一種形式XO，XO 可利用分子氧作為電子受體，在一定的條件并釋放大量的反應(yīng)性氧代謝物使活性大大提高并催化組織中由于缺氧不能進(jìn)一步代謝和分解而積聚的黃嘌呤氧化反應(yīng)，例如組織在低氧狀況下的再?zèng)_氧，從而產(chǎn)生大量的自由基。自由基對(duì)體內(nèi)細(xì)胞膜、DNA、蛋白質(zhì)均有害［14］。XDH/XO 是由兩個(gè)催化活性互不依賴的、相同的亞單位組成的同型二聚體，每個(gè)亞單位相對(duì)分子質(zhì)量約150 ×103，各含一個(gè)活性中心，每個(gè)活性中心包括四個(gè)活性輔助基團(tuán):Mo，F(xiàn)AD，兩個(gè)Fe/S 叢，XDH 轉(zhuǎn)化成XO 初期發(fā)生巰基氧化反應(yīng)，隨后通過(guò)巰基反應(yīng)物處理可逆反應(yīng)，然后由鈣依賴介導(dǎo)從亞單位分子基團(tuán)裂解成一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約為20 ×103的不可逆反應(yīng)［3］。從尿酸代謝途徑的各個(gè)環(huán)節(jié)分析，XDH/XO 是尿酸生成過(guò)多的高尿酸血癥的一個(gè)主要發(fā)病原因。

圖4 不同物種XDH/XO 基因核苷酸序列比對(duì)分析Fig.4 Alignment of XDH/XO gene nucleotide sequence from different species

圖5 不同物種XDH/XO 基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of XDH/XO gene sequences of different species

圖6 SWISS-MODEL 模擬XDH/XO 三維結(jié)構(gòu)Fig.6 Three-dimensional structure of XDH/XO simulated with SWISS-MODEL

圖7 InterProScan 預(yù)測(cè)XDH/XO 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig.7 Prediction of the conserved domain of XDH/XO by InterProScan

本次實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR 的方法對(duì)獼猴新鮮肝臟組織的XDH/XO 基因進(jìn)行了體外擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)RTPCR 擴(kuò)增得到的目的片段顯示其序列共測(cè)到683 個(gè)核苷酸，DNAMAN 軟件預(yù)測(cè)該段核苷酸的氨基酸序列包括了1 個(gè)編碼53 個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框(ORF)，通過(guò)與NCBI 報(bào)道的人類、小鼠、家鼠、野豬的XDH/XO 基因mRNA 互補(bǔ)的cDNA 核苷酸序列同源性比較分析，結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的目的片段與人類同源性最高，為95.6%。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)獼猴的XDH/XO 基因序列還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用RTPCR 參考人類XDH/XO 基因的CDS 區(qū)設(shè)計(jì)引物，并擴(kuò)增出XDH/XO 基因的cDNA 核苷酸片段。生物信息學(xué)分析采用InterProScan 的結(jié)構(gòu)域功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該段XDH/XO 編碼蛋白含有醛氧化/脫氫酶的鉬喋呤結(jié)合點(diǎn)結(jié)構(gòu)域及黃嘌呤脫氫酶結(jié)構(gòu)域，XDH/XO 為同型二聚體，其2 個(gè)亞單位均有1 個(gè)鉬蝶呤輔因子(molybdopterin，Mo-pt)、2 個(gè)Fe/S 簇、1個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸輔基(FAD)，且每個(gè)亞基都可獨(dú)立行使催化功能。在XDH 向XO 轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，F(xiàn)e/S 中心和Mo-pt 中心均無(wú)明顯變化，因此該酶的兩種形式均可催化次黃嘌呤向尿酸的轉(zhuǎn)化，由此推測(cè)所擴(kuò)增的該段XDH/XO 基因編碼的蛋白可能為酶活性中心。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步利用獼猴進(jìn)行高尿酸血癥致病機(jī)理研究及抗高尿酸血癥新藥研發(fā)奠定工作基礎(chǔ)。所獲得獼猴XDH/XO 基因?yàn)檫M(jìn)一步研究尿酸相關(guān)調(diào)節(jié)基因的mRNA 水平的定量分析及蛋白表達(dá)變化奠定了一定工作基礎(chǔ)。

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