張閩，董文賓，張小強

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021）

人體衰老和疲勞等過程都涉及自由基，制備高效的活性肽，開發(fā)新型食品添加劑，評價其清除自由基活性成為首選。明膠雖具有優(yōu)良的物理性質(zhì)[1-2]，可作為乳化劑等廣泛應(yīng)用于食品制造，每年用量達20 萬t，占整個食品級明膠市場的60%以上。但由于其生物價（20）和氨基酸評分（0）比較低，雖然粗蛋白82 % 以上，但很少作為蛋白質(zhì)來源生產(chǎn)活性肽，產(chǎn)品附加值很低。本研究以我國資源豐富的豬皮明膠作為原料，采用不同酶解方法，通過清除DPPH·的方式檢測其抗氧化活性，期望為開發(fā)具有抗疲勞、抗衰老等功效的明膠活性肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

食品級明膠：山東淄博寶恩生物科技有限公司饋贈；胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶（Wolsen），木瓜蛋白酶：北京奧博星生物科技有限公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器

835－50 型氨基酸自動分析儀：日本日立制作所；PHS-3C 型臺式PH 計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS 型恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；JJ-1型精密增力電動攪拌器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；高速冷凍離心機：德國Heraeus 公司；Minimate TFF system 型超濾機：英國PALL 公司；722N 可見光分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；其它為常規(guī)儀器。

1.3 方法

1.3.1 明膠蛋白含量和氨基酸組成的測定

明膠粗蛋白含量的測定參照國標GB/T5009.5-2010，應(yīng)用微量凱氏定氮法；氨基酸組成分析用氨基酸分析儀測定。

1.3.2 明膠活性肽的酶法制備

參考相關(guān)文獻[3-9]酶結(jié)構(gòu)特點和pH 分類，用緩沖液在80 ℃溶解明膠，然后在酶最適活力下水解明膠，具體工藝如表1，水解完成后100 ℃加熱25 min 滅酶，水解液用高速冷凍離心機離心、過濾，澄清后超濾機篩選分子量低于4 000 u 的上清液備用。不同酶解明膠工藝條件見表1。

1.3.3 明膠多肽對DPPH·的清除作用

自由基外圍存在不成對電子，反應(yīng)活性強，存在壽命短，化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定而難以檢測，到目前為止除了H2O2其它自由基的測定仍沒有合適方法。在評估抗氧化活性的方法中[10-11]，DPPH·具有在無水乙醇中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、半衰期長的特點，可通過計算清除率等參數(shù)反映抗氧化劑功效。加之該法在評價活性物功效時不受葡萄糖等雜質(zhì)的干擾，重復(fù)性好，方法靈敏、操作簡單，被廣泛用于衡量樣品的抗氧化能力。

表1 不同酶解明膠工藝條件Table 1 Enzymatic gelatin process conditions

具體實驗步驟如下：用無水乙醇配置0.2 mmol/L的DPPH·溶液，先加待測液，再加無水乙醇，最后加DPPH 溶液，等混勻后在室溫下暗室靜置30 min，測517 nm 處吸收度，用下邊的公式計算樣品對DPPH·自由基的抑制率。抑制率K={1-（Ai-Aj）/Ac}×100%，式中：Ac為對照組；Ai為樣品組；Aj為空白組。

1.3.4 明膠木瓜酶解多肽對DPPH·清除活性試驗的優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、pH、料液比、酶料比為影響因子，以酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率為響應(yīng)值，設(shè)計了4 因素3 水平共30 個試驗點的響應(yīng)面法設(shè)計，對第一階段篩選出來的木瓜酶進行生產(chǎn)工藝優(yōu)化，功效依據(jù)實驗確定。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 明膠的蛋白含量和氨基酸組成

樣品粗蛋白含量測定為90.75%。比目前食品級明膠平均含量82%高。氨基酸組成分析結(jié)果如圖1。

其中非極性氨基酸占69.23 %，甘氨酸最高占37.38%，脯氨酸15.47%；酸性氨基酸占12.87%，堿性氨基酸占8.3%。

2.2 不同酶解明膠產(chǎn)物對DPPH·的清除效果分析

實驗在酶最適條件下用胃蛋白酶，酸性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，堿性蛋白酶，胰蛋白酶水解豬皮明膠，依據(jù)DPPH·清除率檢測抗氧化肽功效，六種酶清除率分別為78.28%、91.87%、79.94%、77.83%、36.53 %、39.42 %；方差分別為0.016、0.018、0.028、0.026、0.022、0.018。清除功效都很穩(wěn)定。

圖1 明膠氨基酸組成色譜圖Fig.1 The chromatograph chart of amino acid composition about pigskin gelatin

結(jié)果分析：①目前，對抗氧化肽的機理尚不清楚。一般說來，構(gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)量及氨基酸的排列順序決定著肽的抗氧化能力。Wu[12]認為，分子量較小的肽具有更高的抗氧化活性。Niranian[13]等發(fā)現(xiàn)，當多肽的N 端為疏水性氨基酸，抗氧化活性較高。Suetsuna[14]等表示，活性肽通過整合金屬離子從而抑制以金屬離子為輔酶的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。此外，抗氧化肽的活性與肽中含有的某些特殊基團有關(guān)，只有在適當分子量時，特殊基團才能得到最大的暴露表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。此外，對目前研究的不同種類的明膠抗氧化肽分析發(fā)現(xiàn)，大多具有重復(fù)的Gly—Pro 序列[15]，豬皮明膠中這兩種氨基酸含量很高，我們推測可能是水解肽抗氧化活性較高的一個原因，進一步有必要分析明膠的氨基酸順序進行驗證。②從酶的結(jié)構(gòu)和pH 分類分析，酸性和胃蛋白酶屬一類，活性部位含有兩個羧基，在酸性范圍活力最適，傾向于剪切芳香族氨基酸或亮氨酸的肽鍵，當氨基端為堿性氨基酸時，水解效果很差；胰和堿性蛋白酶活性中心含有咪唑基，屬于絲氨酸酶，只能水解R1是精氨酸或賴氨酸的肽健，專一性很強；木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白內(nèi)肽酶，作用于L-精氨酸等羧基形成的肽鍵，底物特異性寬泛。中性蛋白酶屬于金屬酶類，和木瓜蛋白酶相似，中性時效果很好。六種酶活性中心和酶解位點有差異，依據(jù)對明膠組成和當前抗氧化肽研究的分析，明膠中非極性氨基酸較多，酸性氨基酸比堿性氨基酸多，適合在酸性（中性）水解，本實驗中酶類篩選與朱夕波[16]研究一致，也符合當前的理論成果。③本研究清除率高于朱夕波等的結(jié)果，原因可能如下：一是原料的不同，兩者原料分子量和蛋白含量存在差異；二是加工工藝不同，朱夕波用酶組合進行水解，清除率30%左右，本研究對工藝進行改進，利用緩沖液溶漲明膠，水解過程使用了攪拌器，酶解液經(jīng)高速離心和超濾處理，活性肽分子量較小。本研究顯示需要對原料進行預(yù)處理，減小明膠的分子量，提高明膠產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，酶解中增加攪拌，產(chǎn)物進行粗分，選擇合適分子量的肽段可提高功效。綜合考慮，酸性蛋白酶解物抗氧化性最佳，木瓜蛋白酶等略低，但不存在統(tǒng)計學(xué)差異，考慮酸性蛋白酶成本較高，建議企業(yè)生產(chǎn)使用木瓜蛋白酶。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜酶解條件試驗結(jié)果

應(yīng)用SPSS12.0 軟件處理木瓜酶解數(shù)據(jù)，對pH（x1），酶解溫度（x2），料液比（x3），酶料比（x4）不同因子對DPPH.清除率（y）的影響進行回歸，得到方程式：

此方程式在pH（pH=3～9）、溫度（30 ℃～80 ℃）、料液比（0.01～0.06）和酶料比（0.01～0.05）范圍內(nèi)，能較好的預(yù)測DPPH·清除率。如果擴大范圍，統(tǒng)計學(xué)檢驗顯著性不強（P＜0.05）。為此，應(yīng)用Design Expert 8.0 軟件對工藝進行優(yōu)化，響應(yīng)面法試驗設(shè)計和結(jié)果見表2 和圖2。

表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Design and resunlts of RSM

圖2 木瓜蛋白酶水解明膠制備活性肽的響應(yīng)面法優(yōu)化Fig．2 Papain hydrolyzed gelatin preparation of active peptide response surface methodology

溫度50.05 ℃、pH 為6.16、料液比為0.043、酶料比0.04 g/g，明膠酶解多肽產(chǎn)物對DPPH 自由基的清除率為89.1%。采用優(yōu)化的酶解條件進行驗證實驗，為方便操作，條件設(shè)為：溫度51℃、pH 為6.16、料液比為0.043 g/L、酶料比0.04 g/g，經(jīng)多次實驗測得多肽產(chǎn)物對DPPH 自由基清除率為（87.4± 0.23）%，相對誤差為0.017，說明響應(yīng)面法優(yōu)化出的工藝可行。

3 結(jié)論

1）明膠酶解前對原料先用檸檬酸—Na2HCO3緩沖液預(yù)先溶漲，水解過程中通過攪拌器攪拌，水解物利用超濾法進行粗分，篩選分子量較小的肽段（＜4 000 u）可以提高水解物的抗氧化功效。

2）不同酶水解明膠產(chǎn)物抗氧化活性有差異，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶功效最佳（不存在統(tǒng)計學(xué)顯著性），從生產(chǎn)成本考慮建議使用木瓜蛋白酶進行酶解。酶動力方程式y(tǒng)=0.330-0.011 x1-0.003 x2+2.114x3+4.646 x4在酶活力適宜條件下可以較好的預(yù)測活性肽對DPPH·的清除率。

3）用響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳水解工藝條件為：溫度50.05 ℃、pH 為6.16、料液比為0.043 g/L、酶料比0.04 g/g，明膠酶解多肽產(chǎn)物對DPPH·的清除率預(yù)計可達到89.1%。實驗數(shù)據(jù)為87.4%。顯示這個工藝可以指導(dǎo)生產(chǎn)。酶法水解明膠還需要對酶進行固定化，相關(guān)的問題還需要繼續(xù)研究。

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