楊 穎 王光明 徐 寧 葛鵬飛 羅毅男 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

缺血后處理對(duì)缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元蛋白酶體活性的影響

楊 穎 王光明 徐 寧 葛鵬飛 羅毅男 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的探討缺血后處理對(duì)短暫腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白酶體活性及氧化性蛋白質(zhì)損傷的影響。方法采用大鼠全腦缺血模型。Wistar大鼠分為缺血組及缺血后處理組，每組按照再灌注時(shí)間進(jìn)一步分為12 h恢復(fù)組，24 h恢復(fù)組，48 h恢復(fù)組及72 h恢復(fù)組。缺血后處理為在腦缺血結(jié)束后給予三個(gè)循環(huán)的30 s缺血和30 s再灌注處理。采用HE染色光鏡觀察腦缺血后神經(jīng)元死亡;用Succinyl-LLVY-AMC作為底物檢測(cè)蛋白酶體的活性變化;差速離心結(jié)合蛋白印跡分析蛋白酶體相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果HE染色顯示缺血后處理顯著降低了腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡;酶活性檢測(cè)，缺血后處理使得蛋白酶體的活性顯著提高;蛋白印跡分析顯示，缺血后處理顯著提高了蛋白酶表達(dá)。結(jié)論缺血后處理能夠顯著改善腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白酶體的活性，降低了缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡。

缺血后處理;腦缺血再灌注;蛋白伴侶hsp70;蛋白伴侶hsp40

缺血后處理是指在腦缺血結(jié)束后，反復(fù)地間斷性阻斷腦血流的恢復(fù)，進(jìn)而達(dá)到腦保護(hù)的目的〔1〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理(Ischemic postconditioning)對(duì)腦缺血再灌注所致的神經(jīng)元延遲性死亡的保護(hù)作用與其能夠降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)〔2，3〕，但是其對(duì)腦缺血再灌注過(guò)程中蛋白酶體的影響尚不清楚。以往研究顯示，在腦缺血再灌注過(guò)程中蛋白酶體的活性顯著下降〔4〕，這被認(rèn)為是導(dǎo)致腦缺血再灌注后神經(jīng)元內(nèi)形成蛋白聚集物的重要病理基礎(chǔ)之一〔5〕。因此本研究中，采用大鼠全腦缺血模型，探討了缺血后處理對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白酶體的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠，280～320 g，80只，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。分為腦缺血組，后處理組;每組又分為假手術(shù)組，12 h恢復(fù)組，24 h恢復(fù)組，48 h恢復(fù)組及72 h恢復(fù)組。每組8只，其中4只用于蛋白印跡分析，4只用于蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 抗熱休克蛋白(hsp)70及hsp40多克隆抗體(美國(guó)Cell signaling公司)。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Bio-rad公司)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(美國(guó)Amersham公司)，其他試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司)，膠片(美國(guó)Kodak公司)。電泳槽及電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。激光掃描共聚焦顯微鏡為德國(guó)產(chǎn)Zeiss LSM 510型;震動(dòng)切片機(jī)為德國(guó)產(chǎn)Leica VT-1000S型。

1.3 方法

1.3.1 全腦缺血模型的制作 全腦缺血模型的制作采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈暫時(shí)夾閉法。動(dòng)物禁食12 h，隨意飲水。先以5%(30%O2，70%N2O)氟烷誘導(dǎo)麻醉，然后以2%濃度維持麻醉。尾動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，同時(shí)注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素。右側(cè)股動(dòng)脈插管備用。頸部正中直切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。顳肌下和直腸內(nèi)分別插入熱敏探頭，監(jiān)測(cè)頭溫和體溫;手術(shù)過(guò)程中用恒溫毯將頭溫和體溫保持在36.8℃ ～37.2℃。缺血時(shí)先用動(dòng)脈瘤夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，經(jīng)股動(dòng)脈抽血將動(dòng)脈壓降至50 mmHg后再進(jìn)行缺血，缺血時(shí)間為15 min。缺血結(jié)束后，除去動(dòng)脈瘤夾并將血液回輸。

1.3.2 缺血后處理方法 腦缺血結(jié)束后，松開動(dòng)脈瘤夾恢復(fù)腦供血30 s，再夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷腦供血30 s;如此反復(fù)，3個(gè)循環(huán)后完全解除頸動(dòng)脈夾閉，徹底恢復(fù)腦供血。見(jiàn)圖1。

1.3.3 腦組織固定 將大鼠麻醉、氣管插管后連接呼吸機(jī)，以3%的氟烷維持麻醉，打開胸腔，暴露心臟，左心室內(nèi)注射0.1 ml(300 IU/kg)肝素后，將導(dǎo)管經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈，先以4℃的PBS液沖洗3 min，然后用4℃含有4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)液灌注3 min，取出腦組織，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中固定24 h(4℃)。

1.3.4 HE染色 將載有腦片的載玻片放置于背光處陰干，用梯度乙醇溶液脫水后置于HE溶液中15 s，沖洗干凈后，放入Scott溶液中10 s，沖洗后放入HE溶液中10 s，再經(jīng)乙醇溶液脫水后進(jìn)行透明處理，加蓋玻片。在高倍顯微鏡下選擇海馬CA1區(qū)進(jìn)行觀察，同時(shí)對(duì)存活的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 胞漿蛋白組分的分離 大鼠麻醉后，迅速斷頭，分離海馬CA1區(qū)腦組織用液氮冷凍保存。將腦組織稱重后，按照重量體積比1:10加入勻漿緩沖液，勻漿器抽壓35次。勻漿組織液以4℃ 6 500 r/min離心20min，抽取上清用于分離胞漿蛋白組分(分離條件為4℃ 75 000 r/min離心1 h，上清即為含有胞漿蛋白的組分)。Bradford法測(cè)定含有胞漿蛋白組分的蛋白濃度后，保存于－20℃冰箱備用。

1.3.6 蛋白印跡分析 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。0.45μm PVDF膜濕法電轉(zhuǎn)膜。室溫下3%胎牛血清(BSA)封閉1 h。置于搖床上與抗蛋白酶體anti-20Sα-1(1∶1 000)，anti-19SS12(1∶1000)在 4℃下孵育過(guò)夜。室溫下與二抗孵育1 h。再與ECL一起孵育1 min，然后經(jīng)過(guò)曝光，顯影，沖洗，定影等步驟。將沖洗后的膠片掃描到電腦中，用Kodak 1D軟件測(cè)定每一個(gè)條帶的灰度值。

1.3.7 蛋白酶體活性檢測(cè) 將10μl(1μg/μl)新鮮制備的海馬CA1區(qū)勻漿混合物至于96孔板內(nèi)，在37°C與10μl的succinyl-LLVY-AMC(300μmol/L)以及 85μl的分析緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，and 20%glycerol)共同孵育30 min，分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用STATA2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 缺血后處理具有保護(hù)短暫腦缺血后神經(jīng)元延遲性死亡的作用 HE染色顯示缺血再灌注后72h，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元幾乎全部死亡，死亡的神經(jīng)元胞漿粉染，胞核固縮深染，呈現(xiàn)多角形。然而缺血后處理組則有部分神經(jīng)元存活。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，缺血組僅有5.21%±1.21%的神經(jīng)元存活;而后處理組存活的神經(jīng)元?jiǎng)t高達(dá)55.32%±5.34%，二者之間具有顯著性差異(P＜0.01)。這提示，缺血后處理對(duì)腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

2.2 缺血后處理能夠顯著改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白酶體的活性 蛋白酶體活性檢查結(jié)果顯示，同假手術(shù)組相比較，在腦缺血再灌注后12 h，24 h和48 h海馬CA1區(qū)內(nèi)蛋白酶體的活性分別降低到45.32% ±4.13%，47.41% ±3.83%和43.52%±4.22%。然而，缺血后處理使海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的蛋白酶體活性分別提高到73.63% ±6.61%，79.23% ±7.14%和77.63%±5.92%。

2.3 缺血后處理能夠顯著提高海馬CA1區(qū)神經(jīng)元蛋白酶體的表達(dá) 蛋白印跡分析顯示，在缺血組中海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白酶體20Sα-1和19SS12亞基的表達(dá)在再灌注后12 h，24 h和48 h呈顯著降低;但是，缺血后處理能夠改善了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)20Sα-1和19SS12亞基的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，二組之間具有顯著性差異。

3 討論

對(duì)于蛋白聚集物形成的機(jī)制，目前較普遍的觀點(diǎn)是，細(xì)胞受到應(yīng)激刺激后，一方面細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊(misfolded);另一方面，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生解鏈(unfolded)而變性〔6，7〕。這兩類異常蛋白質(zhì)都不具有正常的空間結(jié)構(gòu)，使本應(yīng)該位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水集團(tuán)暴露在外面，這些具有黏性的疏水基團(tuán)彼此粘連在一起形成細(xì)胞毒作用的蛋白聚集物〔8〕。蛋白聚集物可以沉積在胞漿中，也可以黏附在線粒體和高爾基體等膜性細(xì)胞器上，影響細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡〔9〕。

細(xì)胞內(nèi)每時(shí)每刻都有錯(cuò)誤折疊蛋白及解鏈蛋白生成，但細(xì)胞內(nèi)并不形成蛋白聚集物，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)存在蛋白質(zhì)量控制(Protein quality control)系統(tǒng)，能夠監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)形成的異常蛋白，并及時(shí)地將其清除掉〔10〕。蛋白酶體是真核細(xì)胞內(nèi)存在的選擇性降解損傷蛋白、錯(cuò)誤折疊蛋白及解鏈蛋白的降解途徑，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)的重要組成部分。以往研究表明，全腦缺血再灌注后，蛋白酶體活性顯著下降，這被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)需要降解的蛋白不能被及時(shí)分解，進(jìn)而這些不具有正常結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)彼此粘連在一起形成具有細(xì)胞毒作用的蛋白聚集物〔11〕。而且，這些暴露了黏性疏水末端的異常蛋白還可以粘連到細(xì)胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu)上，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu)功能障礙，不能執(zhí)行正常的生物功能。因此，改善蛋白酶體的活性能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)異常蛋白的降解，減少細(xì)胞內(nèi)的蛋白聚集物的形成。但是，目前尚缺乏有細(xì)胞的途徑提高腦缺血蛋白酶體的活性。

本研究進(jìn)一步證實(shí)了蛋白酶體活性下降與腦缺血再灌注后神經(jīng)元死亡有密切關(guān)系，還為缺血后處理的腦保護(hù)作用提供了一個(gè)新的途徑。

1 Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarctsize after focal ischemia in rats〔J〕.JCereb Blood Flow Metab，2006;26(9):1114-21.

2 Zhou C，Tu J，Zhang Q，et al.Delayed ischemic postconditioning protects hippocampal CA1 neurons by preservingmitochondrial integrity via Akt/GSK3β signaling〔J〕.Neurochem Int，2011;59(6):749-58.

3 ZhangW，Miao Y，Zhou S，et al.Neuroprotective effects of ischemic postconditioning on global brain ischemia in rats through upregulation of hippocampal glutamine synthetase〔J〕.J Clin Neurosci，2011;18(5):685-9.

4 Ge P，Luo Y，Wang H，et al.Anti-protein aggregation is a potential target for preventing delayed neuronal death after transient ischemia〔J〕.Med Hypotheses，2009;73(6):994-5.

5 Ohtsuka K，Hata M.Molecular chaperone function ofmammalian Hsp70 and Hsp40-a review〔J〕.Int JHyperthermia，2000;16(3):231-45.

6 Schroder M.The unfolded protein response〔J〕.Mol Biotechnol，2006;34(2):279-90.

7 Marciniak SJ，Ron D.Endoplasmic reticulum stress signaling in disease〔J〕.Physiol Rev，2006;86(4):1133-49.

8 StefaniM，Dobson CM.Protein aggregation and aggregate toxicity:new insights into protein folding，misfolding diseases and biological evolution〔J〕.JMol Med，2003;81(11):678-99.

9 Grune T，Jung T，Merker K.Decreased proteolysis caused by protein aggregates，inclusion bodies，plaques，lipofuscin，ceroid and aggresomes during oxidative stress，aging and disease〔J〕.Inter J Biochem Cell Biol，2004;36(12):2519-30.

10 Nishikawa S，Brodsky JL，Nakatsukasa K.Roles ofmolecular chaperones in endoplasmic reticulum(ER)quality control and ER-associated degradation(ERAD)〔J〕.JBiochem(Tokyo)，2005;137(5):551-5.

11 Ge P，Luo Y，Liu C，et al.Protein aggregation and proteasome dysfunction after brain ischemia〔J〕.Stroke，2007;38(13):3230-6.

R749

A

1005-9202(2013)05-1064-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.036

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)(No.30973110);吉林省科技廳(No.200805122)

羅毅男(1951-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事缺血性腦損傷及腦腫瘤的臨床研究。

楊 穎(1984-)，女，在讀碩士，主要從事缺血性腦損傷的臨床研究。

〔2012-11-12收稿 2013-01-10修回〕

(編輯 袁左鳴)