郁 瓊 張 玉 (復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年科，上海 200040)

氯吡格雷單用或與阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用使消化道出血事件明顯增加，加用質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)可減少消化道出血的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。隨著PPIs和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用增多，近年來關(guān)于PPIs對(duì)氯吡格雷療效影響的報(bào)道逐漸增多〔1，2〕。同時(shí)應(yīng)用氯吡格雷與PPIs是否增加心血管不良事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)尚存在爭議〔3，4〕。本研究探討PPIs對(duì)氯吡格雷抑制血栓形成及抑制血小板活性的影響，并研究不同劑量奧美拉唑?qū)β冗粮窭庄熜в绊懙牧啃шP(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 6月齡SD雄性成年大鼠，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。氯吡格雷(杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司)，奧美拉唑(常州四藥制藥有限公司)，埃索美拉唑(阿斯利康制藥有限公司)，泮托拉唑(杭州中美華東制藥有限公司);ADP(美國Sigma公司);甲基纖維素、FeCl3(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);血小板VASP試劑盒(法國Biocytex公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單用氯吡格雷組、奧美拉唑低劑量組、奧美拉唑高劑量組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組，每組10只。各組藥物劑量為氯吡格雷(6.25 mg/kg)、奧美拉唑(10 mg/kg)、奧美拉唑(20 mg/kg)、埃索美拉唑(10 mg/kg)、泮托拉唑(10 mg/kg)。用0.5%甲基纖維素配制PPIs和氯吡格雷懸濁液，每天1次胃內(nèi)灌注(每350 g大鼠1 ml)，共2 ml，連續(xù)7 d。末次服藥后1 h將大鼠麻醉，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈用于制備血栓模型，解剖分離腹主動(dòng)脈取血3～4 ml用于血小板活性檢測(cè)。

1.3 FeCl3誘導(dǎo)頸動(dòng)脈血栓模型制作 參照Kurz法改良制作，用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，頸部消毒、剃毛，解剖分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，長度約1.5 cm，在頸動(dòng)脈下置小片塑料薄膜(2 cm×1.5 cm)，用于保護(hù)血管周圍組織，配制2.16 mol/L(35%)FeCl3溶液，將吸有20 μl FeCl3溶液的小片濾紙(1 cm×1.5 cm)敷于左側(cè)頸總動(dòng)脈上，15 min后取下濾紙片，取下濾紙片60 min后，即制作出頸動(dòng)脈血栓模型。

1.4 血樣本采集和處理 取下濾紙片60 min后，腹部剃毛消毒，于劍突下腹正中線打開腹腔，分離腹主動(dòng)脈，分別從腹主動(dòng)脈取血1.8 ml到含0.2 ml 3.8%枸櫞酸鈉的BD抗凝管中，共2管，輕輕搖晃2次混勻待測(cè)。1管全血樣本制備成貧血小板血漿(PPP)、富血小板血漿(PRP)，用于血小板聚集率的檢測(cè)，血樣本檢測(cè)必須在收集后2 h內(nèi)完成。另一管全血樣本用于VASP-P程度檢測(cè)，血樣本檢測(cè)可在收集后24 h內(nèi)完成。測(cè)試前血樣本室溫(18℃ ～25℃)儲(chǔ)存。

1.5 血栓重量測(cè)定 取血后迅速切下右側(cè)頸動(dòng)脈血栓1.5 cm，放于濾紙上吸干殘血，用電子天平測(cè)定其重量。

1.6 ADP誘導(dǎo)血小板聚集率測(cè)定 采用Born氏比濁法，具體步驟如下:①PRP的制備:用3.8%枸櫞酸鈉抗凝的動(dòng)脈血1.8 ml以1 000 r/min離心10 min，待離心機(jī)自然停止后取出(如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象應(yīng)重新采血)。小心吸取上層血漿即為PRP，移至另一塑料試管并做標(biāo)志，放置30 min后再進(jìn)行檢測(cè)。②PPP的制備:將吸除上層PRP后余下的標(biāo)本以3 000 r/min離心10 min，再吸取上層血漿即為 PPP，調(diào)整 PPP為(10～20)×109/L。③分別吸取PPP和PRP，加入不同玻璃測(cè)試杯內(nèi)，將測(cè)試杯置于恒溫體的預(yù)熱孔中預(yù)熱5 min。④以待測(cè)PPP調(diào)零后，用PPP調(diào)整富血小板血漿至250×109/L，將PPP測(cè)試杯取出，繼而將 PRP測(cè)試杯放入測(cè)試孔。⑤將 ADP(終濃度為5 μmol/L)迅速注入PRP測(cè)試杯，用血液聚集儀測(cè)定最大血小板聚集率(MPAR)。

1.7 VASP-P程度測(cè)定 該試劑盒是通過VASP磷酸化狀態(tài)來檢測(cè)P2Y12受體的活性。采用流式細(xì)胞術(shù)，具體步驟如下:①加樣:塑料管編號(hào)為 T1、T2、T3，T1 加 10 μl PGE1(終濃度10 μmol/L)，T2、T3 加 10 μl PGE1+ADP(終濃度10 μmol/L)，每管加10 μl全血，震蕩混勻器低速混勻2 s，室溫孵育10 min。②固定:在T1、T2、T3管中各加10 μl 3%多聚甲醛室溫下固定，震蕩混勻器低速混勻1～2 s，室溫孵育5 min。③細(xì)胞透化和免疫標(biāo)記:T1、T2加10 μl抗VASP-P鼠單克隆抗體+透化劑，T3加10 μl陰性同型對(duì)照+透化劑，震蕩混勻器低速混勻1～2 s，室溫孵育5 min。④熒光標(biāo)記和血小板計(jì)數(shù)標(biāo)記:T1、T2、T3管各管加10 μl抗CD61-PE，震蕩混勻器低速混勻1～2 s，室溫暗處孵育5 min。3管中加2 ml稀釋劑后立即置2～8℃冰箱，24 h內(nèi)上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。⑤流式細(xì)胞分析:比較兩種測(cè)試狀態(tài)，去評(píng)估每個(gè)樣本中ADP抑制VASP磷酸化的能力。根據(jù)靜息態(tài)(PGE1)和激活態(tài)(PGE1+ADP)矯正的平均熒光強(qiáng)度(MFI)計(jì)算血小板反應(yīng)性指數(shù)(PRI)，該指數(shù)反映P2Y12受體的抑制程度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Stata7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，兩樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PPIs與氯吡格雷聯(lián)用對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響 氯吡格雷組的血栓重量顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。高劑量奧美拉唑組、低劑量奧美拉唑組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組的血栓重量與單用氯吡格雷組相比均無顯著差異(P＞0.05)。但高劑量奧美拉唑組的血栓重量顯著高于低劑量奧美拉唑組(P＜0.05)。見表1。

2.2 PPIs與氯吡格雷聯(lián)用對(duì)大鼠ADP誘導(dǎo)血小板聚集率的影響 氯吡格雷組的血小板聚集率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。高劑量奧美拉唑組、低劑量奧美拉唑組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組的血小板聚集率與單用氯吡格雷組相比無顯著差異(P＞0.05)。但高劑量奧美拉唑組的血小板聚集率顯著高于低劑量奧美拉唑組(P＜0.05)。見表1。

2.3 PPIs與氯吡格雷聯(lián)用對(duì)大鼠血小板VASP-P程度(PRI)的影響 單用氯吡格雷組的PRI顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。高劑量奧美拉唑組、低劑量奧美拉唑組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組的PRI與單用氯吡格雷組相比均無顯著差異(P＞0.05)。但高劑量奧美拉唑組的PRI顯著高于低劑量奧美拉唑組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組血栓重量、血小板聚集率、PRI結(jié)果( ± s，n=10)

與空白對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與低劑量奧美拉唑組比較:2)P＜0.05

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3 討論

氯吡格雷是P2Y12受體拮抗劑，通過選擇性地與血小板表面ADP受體結(jié)合，阻斷ADP對(duì)腺苷酸環(huán)化酶(AC)的抑制作用，促進(jìn)血管舒張刺激磷蛋白(VASP)磷酸化，抑制纖維蛋白原與其血小板受體GPⅡb/Ⅲa結(jié)合而發(fā)揮抗血小板聚集作用及抗血栓形成作用。比濁法測(cè)定血小板聚集率在臨床應(yīng)用廣泛，該方法比較方便、快速，成本低，成為金標(biāo)準(zhǔn)。此法在樣品處理過程中需離心，導(dǎo)致部分血小板激活和丟失等;而當(dāng)血液中的一些大分子物質(zhì)如脂蛋白、膽紅素等增多時(shí)會(huì)影響血漿濁度，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果，故重復(fù)檢測(cè)變異大。運(yùn)送過程中如有劇烈晃動(dòng)，容易造成血小板失活。肝素會(huì)影響ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率，因其可通過ADP作用于P2Y1受體誘導(dǎo)短暫的血小板聚集〔5〕。所以通過ADP誘導(dǎo)血小板聚集率反映氯吡格雷的抗血小板作用存在一定局限性。VASP檢測(cè)采用全血，故用血量少、無需離心，不是通過直接檢測(cè)血小板聚集所以不易受體外血小板激活的影響，具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性〔6〕。因此，在臨床研究中應(yīng)用中優(yōu)于血小板聚集率測(cè)定。目前，VASP檢測(cè)臨床研究應(yīng)用較少。

本研究發(fā)現(xiàn)PPIs和氯吡格雷聯(lián)合使用沒有增加大鼠頸動(dòng)脈血栓重量，對(duì)血栓形成沒有影響。因此認(rèn)為PPIs對(duì)氯吡格雷的抗血栓作用沒有影響，不會(huì)增加心血管風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果與國外前瞻性研究結(jié)論一致〔3，4〕。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)不同PPIs對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板聚集率、VASP-P程度沒有顯著影響，認(rèn)為PPIs對(duì)氯吡格雷抗血小板活性沒有影響。然而多項(xiàng)藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)奧美拉唑顯著降低了氯吡格雷的抗血小板活性，埃索美拉唑、泮托拉唑?qū)β冗粮窭椎寞熜]有影響〔7～9〕，推測(cè)PPIs對(duì)氯吡格雷療效影響的機(jī)制是由于PPIs和氯吡格雷均通過CYP450酶(主要為CYP2C19、CYP3A4)代謝，PPIs通過競爭CYP450同工酶而影響氯吡格雷轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，使氯吡格雷抗血小板活性減弱。奧美拉唑?qū)YP2C19的親和力最強(qiáng)。CYP2C19基因多態(tài)性也是影響氯吡格雷及其代謝物的藥動(dòng)學(xué)和抗血小板活性的重要因素〔10〕。但本研究結(jié)果稍有不同，分析可能的原因:①本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究方法，研究對(duì)象的同質(zhì)性較好。研究時(shí)避免了其他經(jīng)CYP2C19代謝的藥物的影響。最重要的是排除了冠心病的主要危險(xiǎn)因素，如高脂血癥、糖尿病、吸煙、肥胖等，這些因素可能會(huì)影響血小板聚集功能。②藥物往往可以通過兩種以上的CYP450酶代謝，當(dāng)其中一種受抑制時(shí)其他CYP450酶的活性可不受影響或代償性增加，這種情況下藥物代謝整體受影響可能不大，如果藥物的治療范圍足夠大，其效應(yīng)甚至沒有變化。氯吡格雷在肝臟的氧化過程由多個(gè)CYP450的同工酶系統(tǒng)參與〔11〕，CYP2C19不是氯吡格雷的唯一代謝活化途徑，它可通過其他活化途徑(CYP3A4、CYP3A5、CYP1A2、CYP2B6等)代償。③雖然有藥理學(xué)研究顯示同時(shí)應(yīng)用氯吡格雷與PPIs可降低前者的抗血小板療效，但是PPIs對(duì)氯吡格雷抗血小板療效的影響可能尚未達(dá)到引起臨床不良后果的程度。與之相似的阿托伐他汀和氯吡格雷(CYP3A4代謝)的相互作用，有研究表明阿托伐他汀可能會(huì)影響氯吡格雷的抑制血小板作用，并沒有產(chǎn)生具有臨床意義的不良后果〔12〕。④CYP2C19基因多態(tài)性不一定會(huì)影響氯吡格雷的療效。O'Donoghue等〔3〕研究顯示攜帶CYP2C19功能缺失的基因與心血管事件風(fēng)險(xiǎn)增加無關(guān)(HR=0.76，CI:0.39～1.48)。因此這兩類藥物的相互作用不一定會(huì)對(duì)氯吡格雷的抑制血小板活性產(chǎn)生影響。

根據(jù)本文結(jié)果，筆者推測(cè)奧美拉唑?qū)β冗粮窭椎挠绊懣赡艽嬖谝欢▌┝恳蕾囆?，而本?xiàng)研究劑量尚未達(dá)到可顯著降低氯吡格雷抗血小板活性的程度。因此建議高劑量奧美拉唑和氯吡格雷聯(lián)用時(shí)仍需謹(jǐn)慎。

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