彭 程，牟甜甜，趙祚全，馬云川，張現(xiàn)忠,3

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院 PET中心，北京 100053；2.放射性藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100875；3. 分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門 361005；4. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100029 )

心肌灌注顯像在冠心病的早期診斷和預(yù)后評價(jià)中起著非常重要的作用。隨著正電子發(fā)射斷層掃描(PET)技術(shù)的發(fā)展與普及，越來越多的18F標(biāo)記心肌灌注顯像劑被報(bào)道，成為放射性藥物研究的新熱點(diǎn)。

MC-Ⅰ(線粒體復(fù)合體Ⅰ)抑制劑類似物在已報(bào)道的18F標(biāo)記的心肌灌注顯像劑中生物性能較為突出[1]。尤其是抑制劑噠螨靈的衍生物，如BMS-747158-02(flurpiridaz)[2-9]、18F-FP1OP[10]等，都是以噠嗪酮為藥效團(tuán)，具有較高的心肌攝取和良好的靶與非靶組織放射性攝取比(T/NT)，具有進(jìn)一步臨床應(yīng)用的前景(flurpiridaz已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入III期臨床試驗(yàn))。

噠螨靈的結(jié)構(gòu)由“頭盔”、連接鏈以及側(cè)鏈組成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1。Purohit等[11]對它的衍生物進(jìn)行了IC50的測定，做了較深入的構(gòu)效關(guān)系研究。但是上述研究都是基于噠螨靈結(jié)構(gòu)中的噠嗪酮部分或連接鏈部分，并未涉及側(cè)鏈中苯環(huán)的結(jié)構(gòu)修飾。本課題組[12]于2011年報(bào)道了18F-FPTP2，其生物分布結(jié)果表明，噠螨靈的苯環(huán)具有一定的可修飾性，在苯環(huán)上引入雜原子并改變苯環(huán)取代基的位置，并不會(huì)影響該類化合物的心肌攝取。這說明噠螨靈側(cè)鏈中的苯環(huán)具有較大的可修飾性。因此，側(cè)鏈中的苯環(huán)是否屬于影響噠螨靈心肌攝取的核心結(jié)構(gòu)，去掉苯環(huán)是否會(huì)影響該類化合物在心肌中的攝取，值得進(jìn)一步研究。另外，已報(bào)道的18F-FP1OP和18F-FP2OP[13]的穩(wěn)定性較差，不利于臨床使用，因此需要設(shè)計(jì)合成一種更為穩(wěn)定的化合物。鑒于此，本工作擬嘗試對噠螨靈進(jìn)行進(jìn)一步修飾，去掉其側(cè)鏈中的苯環(huán)，制備結(jié)構(gòu)更為簡單的2-特丁基-4-氯-5-(2-氟[18F]乙氧基)-2H-3-噠嗪酮(18F-FP2)，以研究該類標(biāo)記物的穩(wěn)定性及苯環(huán)的存在對于該類化合物心肌攝取的影響。

圖1 噠螨靈的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of pyridaben

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

高效液相色譜儀島津LC-20AT：日本島津公司產(chǎn)品；AVATAR 360 紅外光譜：美國Nicolet公司產(chǎn)品；Avance 500核磁共振譜儀：瑞士Bruker A.G.公司產(chǎn)品；RM-905a放射性活度計(jì)：中國計(jì)量科學(xué)研究院產(chǎn)品；Venusil MP-C18半制備色譜柱，250 mm×10 mm，5 μm：美國Agela Technologies公司產(chǎn)品；DYY-Ⅲ電泳儀：北京科學(xué)儀器修配廠產(chǎn)品；WALLAC/WIZARD 1470γ計(jì)數(shù)儀：美國PerkinElmer公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

18F-：北京宣武醫(yī)院提供；乙二醇(99%)、對甲基苯磺酰氯(98%)、正四丁基氟化銨(1 mol/L四氫呋喃溶液)、碳酸銫(99%)、糠醛(98%)、二異丙基乙胺(DIPEA)(99%)：Alfa Aesar公司產(chǎn)品；叔丁基肼鹽酸鹽(98%)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)(99%)：Acros Organics公司產(chǎn)品；Kryptofix2.2.2.(K2.2.2)：Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 19F-FP2的合成

2-特丁基-4-氯-5-(2-氟[19F]乙氧基)-2H-3-噠嗪酮(2-tert-butyl-4-chloro-5-(2-[19F]fluroethoxy)-2H-pyridazin-3-one,19F-FP2)的合成路線示于圖 2。其中，2-特丁基-4,5-二氯噠嗪酮(2-tert-butyl-4.5-dichloro-2H-pyridazin-3-one，DCP)的合成參考文獻(xiàn)[13]。

將0.515 g(2 mmol)DCP、0.372 g(6 mmol)乙二醇、1.955 g(6 mmol)碳酸銫和10 mL DMF于68 ℃油浴反應(yīng)12 h。冷卻后用100 mL乙酸乙酯稀釋，抽濾。濾液經(jīng)100 mL水洗滌5次后，用無水MgSO4干燥。抽濾后旋蒸濾液，經(jīng)200～300目的硅膠柱純化，展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶3。得到0.39 g白色固體，即 2-特丁基-4-氯-5-(2-羥基)-2H-3-噠嗪酮(2-tert-butyl-4-chloro-5-(2-hydroxy)-2H-pyridazin-3-one, I-2OH)，產(chǎn)率80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.581 (s, 9H, N(CH3)3)、2.142 (s, 1H, CH2OH)、3.946 (t, 2H, CH2OH)、4.268 (t, 2H, CH2CH2OH)、7.707 (s, 1H, N=C-H)。

將0.247 g(1 mmol)I-2OH、0.229 g(1.2 mmol)對甲基苯磺酰氯、0.146 g(1.2 mmol)4-二甲氨基吡啶、0.155 g(1.2 mmol)二異丙基乙胺和50 mL無水二氯甲烷加至100 mL茄形瓶中，室溫?cái)嚢? h。旋蒸除溶劑后，反應(yīng)液用100 mL乙酸乙酯溶解，分別用100 mL 0.1 mol/L HCl和100 mL水洗滌。有機(jī)相用無水Na2SO4干燥，抽濾后旋蒸濾液，用200～300目的硅膠柱純化，展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1，得到0.25 g白色固體，即2-特丁基-4-氯-5-(2-對甲基苯磺酰基)-2H-3-噠嗪酮(2-tert-butyl-4-chloro-5-(2-tosyl)-2H-pyridazin-3-one, OTs-P2)，產(chǎn)率63%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.569 (s, 9H, N(CH3)3)、2.383 (s, 3H, phenyl-CH3)、4.312～4.367 (m, 4H, CH2CH2OH)、7.283 (d, 2H, CH3-phenyl)、7.757 (s, 1H, N=C-H)、7.734 (m, 2H, SO3-phenyl)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ: 21.70、 27.84、66.55、67.70、67.82、118.46、124.90、127.95、130.03、132.39、145.39、153.21、158.80；ESI-MS C17H21ClN2O5S: 計(jì)算值為400.1，實(shí)驗(yàn)值為401.3; 元素分析C17H21ClFN2O5S: 計(jì)算值為C50.93%, H5.28%, N6.99%；實(shí)驗(yàn)值為C50.82%, H4.65%, N6.61%。IR (CH2Cl2，cm-1) v: 1 634 (C=O), 1 274 (=C—O—C)；熔點(diǎn)：104～105 ℃。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果確定產(chǎn)物為目的化合物。

將1 mL 1 mol/L 四正丁基氟化銨的THF溶液加至25 mL反應(yīng)瓶中，110 ℃氮?dú)獯蹈?。加? mL無水乙腈蒸發(fā)至干，重復(fù)3次。將0.200 g(0.5 mmol)OTs-P2溶于10 mL無水乙腈，加至反應(yīng)瓶中，回流40 min。反應(yīng)液經(jīng)旋蒸后，用20 mL二氯甲烷溶解，用20 mL水洗滌。有機(jī)相用MgSO4干燥，抽濾后旋蒸濾液，經(jīng)200～300目硅膠柱純化，展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1，得到112 mg白色固體，即19F-FP2，產(chǎn)率65%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.626 (s, 9H, N(CH3)3)、3.141 (dt, 2H, CH2CH2F)、4.597～4.829 (m, 6H, CH2CH2-triazolyl-CH2CH2CH2F)、7.656 (s, 1H, N=C—H)、7.729 (s, 1H, triazolyl)。13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ: 27.28 (d, J=22 Hz), 27.83、49.43、66.74、68.66；82.33 (d, J=167 Hz)、118.34、124.36、153.03、158.77；熔點(diǎn)：87～88 ℃。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，產(chǎn)物為目標(biāo)化合物。

圖2 19F-FP2的合成路線Fig.2 The synthesis route of 19F-FP2

2.2 18F-FP2的合成

18F-FP2的合成路線示于圖 3。

將0.3 mL含有3 mg K2CO3的水溶液和1 mL含有11 mg K2.2.2的乙腈溶液混合，用上述混合液將18F-從QMA柱淋洗至10 mL反應(yīng)瓶中，110 ℃氮?dú)獯蹈?。加?.5 mL無水乙腈蒸發(fā)至干，重復(fù)3次。將2 mg OTs-P2溶于1 mL 無水乙腈，加至反應(yīng)瓶中，90 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，注入C18 反相半制備柱，收集保留時(shí)間為16.5～17.5 min的組分，即為18F-FP2。HPLC條件為：A相為水，B相為乙腈；淋洗梯度：0～5 min 95%A，5.01～8 min 95%～60%A，8.01～19 min 60%～30%A。

圖3 18F-FP2的合成路線Fig.3 The synthesis route of 18F-FP2

2.3 18F-FP2的穩(wěn)定性

將1.85 MBq經(jīng)HPLC純化后的18F-FP2溶于1 mL水中，在室溫下放置3 h，每隔1 h取0.2 mL溶液，采用HPLC檢測其放化純度。

2.4 18F-FP2脂水分配系數(shù)的測定

配制0.025 mol/L KH2PO4溶液，加入適量NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至7.4，得到PBS緩沖溶液，加入與之等體積的正辛醇，充分振蕩后室溫靜置1 d以上。取上層正辛醇0.6 mL，下層PBS液0.58 mL，并取0.02 mL18F-FP2水溶液混合，用渦旋混合器振蕩3～5 min，充分混勻。然后離心5 min，在有機(jī)相和水相中分別平行取3個(gè)樣，每個(gè)樣0.1 mL，用γ計(jì)數(shù)器測量其放射性活度，每個(gè)樣品平行測定3次。計(jì)算分配系數(shù)lgP值。

2.5 18F-FP2在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

由正常昆明小鼠尾靜脈注射0.1 mL18F-FP2水溶液(0.185 MBq)，注射后2、15、30和 60 min將其斷頭處死。取心、肝、脾、肺、肉、骨、血、腎等有關(guān)組織和器官，擦凈后稱重，并在γ計(jì)數(shù)器上測定放射性活度，計(jì)算各組織的每克百分注射劑量率(%ID/g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-FP2的放化產(chǎn)率及放化純度

從18F-起，至純化完畢，制備總時(shí)間為70～90 min，衰變校正后的放化產(chǎn)率為53.0%±5.2%。產(chǎn)物的放化純度>98%，比活度約為20 TBq/g。18F-FP2及19F-FP2的HPLC譜圖示于圖4。由圖4可以看出，18F-FP2的保留時(shí)間為16.7 min，和相應(yīng)的參考物質(zhì)19F-FP2的保留時(shí)間16.5 min一致。說明所得到的標(biāo)記物為目標(biāo)產(chǎn)物18F-FP2。

圖4 19F-FP2和18F-FP2的HPLC圖譜Fig.4 The HPLC chromatograms of 19F-FP2 and 18F-FP2

3.2 18F-FP2的穩(wěn)定性研究

18F-FP2在水溶液中放置3 h后的HPLC譜圖示于圖5。由圖 5可見，18F-FP2在水溶液中的穩(wěn)定性較好，室溫放置3 h后，放化純度仍>98%。與先前報(bào)道的18F-FP1OP[10]、18F-FP2OP[13]相比，其在水溶液中的穩(wěn)定性有顯著提高。較好的穩(wěn)定性是藥物臨床推廣使用的前提，也為將來設(shè)計(jì)穩(wěn)定的標(biāo)記化合物提供參考。

圖5 18F-FP2在水溶液中室溫放置3 h后的HPLC譜圖Fig.5 The HPLC chromatograms of 18F-FP2，incubated in water for 3 h

3.3 18F-FP2脂水分配系數(shù)的測定

實(shí)驗(yàn)測得18F-FP2的lgP為0.42±0.02，表明其為脂溶性物質(zhì)。但是其親脂性明顯低于先前報(bào)道的化合物(18F-FP1OP[10]和18F-FP2OP[13])，這與標(biāo)記化合物結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈苯環(huán)的去除有直接關(guān)系。

3.4 18F-FP2在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

18F-FP2在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。由表1數(shù)據(jù)可見，18F-FP2在小鼠肝、肺等器官具有很高的初始攝取，但是清除也很快。在心肌中的初始攝取較低，僅為(4.09±0.53)%ID/g，且清除較快。心肌的低攝取使T/NT較不理想，不符合心肌灌注顯像劑的基本要求。這說明去除噠螨靈結(jié)構(gòu)中的芳環(huán)，會(huì)嚴(yán)重影響化合物在心肌中的攝取。側(cè)鏈中的芳環(huán)為噠螨靈衍生物保持心肌高攝取的必需基團(tuán)。

4 結(jié) 論

本工作設(shè)計(jì)并制備了一種18F標(biāo)記的噠嗪酮類似物18F-FP2，其校正后的放化產(chǎn)率為53.0%±5.2%，放化純度>98%，比活度約為20 TBq/g。18F-FP2為脂溶性化合物，且在水溶液中的穩(wěn)定性較好，室溫放置3 h放化純度仍>98%。小鼠生物分布結(jié)果顯示，該標(biāo)記物在心肌中的初始攝取較低且清除較快，不適于心肌顯像。

表1 18F-FP2在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

綜上所述，本研究雖然獲得了穩(wěn)定性更好的標(biāo)記化合物，但是由于標(biāo)記側(cè)鏈上的苯環(huán)去除后大幅降低了心肌攝取，使其不適合用于心肌顯像。鑒于此，建議今后在該類標(biāo)記物的設(shè)計(jì)中應(yīng)保留噠嗪酮側(cè)鏈的芳環(huán)結(jié)構(gòu)。

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