孫友友 陳元彩，，* 胡勇有

(1.華南理工大學(xué)制漿造紙工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640;2.華南理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州，510006)

近年來(lái)，隨著人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的日益重視以及各種生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，由多種微生物組成的復(fù)合菌群越來(lái)越受到關(guān)注，復(fù)合菌群使用方便，經(jīng)濟(jì)安全，在解決環(huán)境污染問(wèn)題方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?］。通過(guò)微生物混合培養(yǎng)(如 EM 技術(shù)［2］、H.S.B.技術(shù)［3］和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法［4-6］等)制成的復(fù)合菌群比單一菌株在廢水處理上的應(yīng)用更具有實(shí)際意義。Chen等［4-6］以6株菌株為供試菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建優(yōu)勢(shì)復(fù)合菌群處理制漿造紙廢水。首先進(jìn)行部分因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選出降解顯著的菌株，再通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)面法分析的中心點(diǎn)，最后由響應(yīng)面法分析得到復(fù)合菌群中各菌處理制漿造紙廢水的最優(yōu)細(xì)胞濃度，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，COD去除率的模型預(yù)測(cè)值是實(shí)際值的 97.2%。

制漿造紙廢水排放量大，廢水中含有樹(shù)脂、纖維素、木素、木素降解產(chǎn)物及其衍生物等，表現(xiàn)為堿度大、色度大、難降解物質(zhì)含量高、耗氧量大等特點(diǎn)，對(duì)生態(tài)環(huán)境有嚴(yán)重危害［7］。Bacillus sp.(芽孢桿菌)、Enterobacter cloacae(陰溝腸桿菌)、Gordonia sp.(戈登氏菌)和Pseudomonas putida(惡臭假胞桿菌)常用于處理制漿造紙廢水。Raj等［8］采用Bacillus sp.搖瓶處理制漿造紙廢水，色度、木素、BOD、COD的去除率最高分別達(dá)到61%、53%、82%、78%;成佳琪等［9］以Enterobacter cloacae和另外3種細(xì)菌構(gòu)建的優(yōu)勢(shì)菌群好氧顆粒污泥強(qiáng)化后，對(duì)經(jīng)厭氧活性污泥處理后的制漿造紙廢水進(jìn)行深度處理，廢水的CODCr和色度分別下降了67.3%和60%;Chen等［10］以Gordonia sp.同屬的Gordonia strain JW8接種于序列間歇式反應(yīng)器(SBR)生物強(qiáng)化處理制漿造紙廢水，BOD和COD的去除率最高分別達(dá)到96.4%和87.8%，BOD/COD 的比值也有所降低;Chandra等［11］以Pseudomonas putida和另2種細(xì)菌組成的微生物團(tuán)聚體活性污泥法處理制漿造紙廢水，曝氣24 h廢水的色度、BOD、COD、酚醛、硫化物的去除率分別達(dá)到97.0%、96.6%、96.8%、96.9%、96.7%。Xz6-1為Chen等［12］用一種白腐真菌和一種細(xì)菌跨界融合篩選出的處理制漿造紙廢水的高效菌種，因其兼具有真菌和細(xì)菌的優(yōu)良性狀，本實(shí)驗(yàn)中的 PB-3、PE-9［13］、PG-1、Ppp-3也是用同樣方法篩選出的高效融合菌。

本研究運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建制漿造紙廢水復(fù)合菌群，首先進(jìn)行Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)，研究了對(duì)制漿造紙廢水COD去除率影響較大的顯著菌株，由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定顯著菌株的中心點(diǎn)，結(jié)合中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用響應(yīng)面法分析，評(píng)估處理過(guò)程中菌株之間的交互作用，構(gòu)建出用于處理制漿造紙廢水的高效復(fù)合菌群，并進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，考察模型預(yù)測(cè)的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用廢水

首先采用進(jìn)口桉木片進(jìn)行硫酸鹽法置換蒸煮(用堿量21%，其中上抽提用堿量占總用堿量的60%)。實(shí)驗(yàn)用廢水由蒸煮黑液以及一定量的碳源和氮源混合而成?；旌蠌U水的COD為820 mg/L，調(diào)節(jié)廢水pH值至7.0，將廢水注入300 mL錐形瓶中，封蓋，在121℃下滅菌15 min。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

芽孢桿菌(Bacillus sp.，B)，陰溝腸桿菌(Enterobacter Cloacae，E)，戈登氏菌(Gordonia sp.，G)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida，Pp)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，而 Xz6-1、PB-3、PE-9［11］、PG-1和Ppp-3為實(shí)驗(yàn)室篩選分離得到(見(jiàn)表1)。

表1 5株篩選分離得到的菌株菌落表面形態(tài)特征

細(xì)菌培養(yǎng)基(1 L):牛肉膏用量1.5 g，葡萄糖用量1.0 g，胰蛋白胨用量6.0 g，酵母粉用量3.0 g，pH 值 7.0。

1.1.3 試劑與溶液

磷酸鹽緩沖液(PBS):NaCl質(zhì)量濃度8 g/L，KCl質(zhì)量濃度 0.2 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度 0.2 g/L，K2HPO4質(zhì)量濃度 1.15 g/L。

0.25 mol/L K2Cr2O7標(biāo)準(zhǔn)溶液:取 12.258 g分析純K2Cr2O7在烘箱中(120℃)烘干2 h，冷卻至室溫后溶于少量蒸餾水中，定容至1000 mL，搖勻備用。

Ag2SO4-H2SO4(1%):在500 mL濃H2SO4中加入5 g Ag2SO4，放置1～2天，經(jīng)常攪拌使其溶解。

COD 消 解 液(1 L):7.5 g HgSO4、750 mL Ag2SO4-H2SO4及250 mL K2Cr2O7標(biāo)準(zhǔn)液混合。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的配制及菌體濃度測(cè)定

從斜面上分別挑取1～2環(huán)9種供試菌接種到含細(xì)菌培養(yǎng)基的300 mL錐形瓶中，35℃恒溫?fù)u床(150 r/min)中培養(yǎng)，在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，分別獲得9種菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或穩(wěn)定期細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞用PBS洗滌2～3次，所得菌體分別懸浮于PBS中，得到菌懸液，在4℃冰箱中放置待用。菌懸液適當(dāng)稀釋后，以去離子水為空白，用安捷倫-8453 UV-vis分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD600值(紫外600 nm處吸光度)，以此表示菌懸液中的細(xì)胞濃度。

1.2.2 廢水COD測(cè)定

廢水COD用HACH COD測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。在HACH COD消解-比色管中依次加2 mL廢水試樣，4 mL COD消解液，密封后搖勻，置于預(yù)熱后的HACH COD消解器中，恒溫150℃消解120 min。待冷卻至120℃左右時(shí)取出搖勻，冷卻至室溫。用DR890便攜式分光光度計(jì)在所設(shè)定的波長(zhǎng)下測(cè)定COD。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 降解實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，將收集的菌懸液加入到含100 mL混合廢水的300 mL錐形瓶中，150 r/min、35℃條件下振蕩培養(yǎng)，每天取出培養(yǎng)液檢測(cè)其COD。COD去除率達(dá)到最大值時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建高效復(fù)合菌群主要通過(guò)PB［14］實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)［15］及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［16］等步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立主要采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Minitab和Matlab來(lái)完成。

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用優(yōu)化后的復(fù)合菌群進(jìn)行制漿造紙廢水降解實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證檢測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值是否相符，進(jìn)行可靠性分析，得到最佳復(fù)合菌群組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 PB設(shè)計(jì)篩選高效降解菌種

利用Minitab 16軟件，采用PB兩水平法設(shè)計(jì)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)，對(duì) B(X1)、E(X2)、G(X3)、Pp(X4)、PB-3(X5)、PE-9(X6)、PG-1(X7)、Ppp-3(X8)和Xz6-1(X9)(X1～X9代表菌懸液的細(xì)胞濃度，以O(shè)D600值表示。)等9種菌株進(jìn)行考察，每種菌株分別取高(+1)、低(-1)2個(gè)水平，響應(yīng)值(Y)為制漿造紙廢水COD去除率最大值(Rmax)，篩選出影響廢水COD去除率的顯著菌種。同時(shí)進(jìn)行3組中心水平實(shí)驗(yàn)(OD600編碼水平為0)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，各因子的水平與效應(yīng)分析見(jiàn)表3。

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的效應(yīng)評(píng)價(jià)

經(jīng)回歸擬合得到多元一次回歸方程:Y=71.5417+6.0083X1-0.825X2+1.2917X3+4.9417X4+0.3917X5+5.575X6-0.6917X7+0.1583X8+3.7583X9。該方程決定系數(shù)為 R2=0.9870，表示方程回歸良好。利用SPSS軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，PB分析實(shí)驗(yàn)與中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)所獲得的COD去除率之間不存在明顯差異(sig＞0.05)，說(shuō)明PB實(shí)驗(yàn)中所采用的細(xì)胞濃度遠(yuǎn)離最優(yōu)值。由表3可知，對(duì)制漿造紙廢水COD去除率影響的9菌株中，有4個(gè)顯著性因素(P值＜0.05)，其排列次序?yàn)?B＞PE-9＞Pp＞Xz6-1，依此確定對(duì)該4種菌株進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。而其他菌株細(xì)胞濃度的取值則根據(jù)各菌株效應(yīng)的正負(fù)和大小確定，正效應(yīng)的菌株均取較高值，負(fù)效應(yīng)的菌株均取較低值。因此，其他5種菌株的細(xì)胞濃度(OD600值)為:E(0.2)、 G(0.3)、 PB-3(0.3)、 PG-1(0.2)、Ppp-3(0.3)。

2.2 中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的確定

由PB實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)評(píng)價(jià)及其擬合方程可知，對(duì)制漿造紙廢水COD去除率有顯著效應(yīng)的4種菌株中，B(X1)，PE-9(X6)，Pp(X4)，Xz6-1(X9)均呈現(xiàn)正效應(yīng)(效應(yīng)＞0)，若要提高COD去除率，需適當(dāng)提高這4種菌的濃度;而非顯著性效應(yīng)的菌種E(X2)和PG-1(X7)呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)(效應(yīng)＜0)，在降解過(guò)程中需適當(dāng)降低其濃度;且在廢水降解過(guò)程中培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在不斷減少，菌株的有害物質(zhì)不斷積累，因此顯著性菌株的細(xì)胞濃度不是越大越好。對(duì)這4種菌株設(shè)定它們的變化步長(zhǎng)進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，4#實(shí)驗(yàn)廢水COD的Rmax最高，再進(jìn)一步增加細(xì)胞濃度無(wú)法增加其響應(yīng)值，提示最優(yōu)點(diǎn)在此附近。因此，菌懸液以B(0.34)、Pp(0.37)、PE-9(0.40)和 Xz6-1(0.34)作為中心組合設(shè)計(jì)(Central composite design，CCD)的中心進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.3 中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法分析結(jié)果

以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到的最佳菌種的細(xì)胞濃度為中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，以COD去除率最大值Rmax(Y)為響應(yīng)值，以B(x1)、Pp(x4)、PE-9(x6)和Xz6-1(x9)4因素為自變量，每個(gè)因素取5個(gè)水平，以(-2，-1，0，1，2)編碼。按方程Xi=(xi-x0)/Δx對(duì)自變量進(jìn)行編碼(Xi為自變量編碼值，xi為自變量的真實(shí)值，x0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，Δx為自變量的變化步長(zhǎng))。共安排了30組實(shí)驗(yàn)，其中立方點(diǎn)16個(gè)，用于估計(jì)線性和交互作用效應(yīng)，軸點(diǎn)8個(gè)，用于估計(jì)二次項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)變量及水平見(jiàn)表5，中心組合設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)變量及水平

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果得到的各因素效應(yīng)系數(shù)，建立對(duì)廢水COD去除率的響應(yīng)模型，通過(guò)Minitab軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合的二次多項(xiàng)式方程為:

對(duì)多元回歸方程進(jìn)行方差分析(見(jiàn)表7)，經(jīng)F值檢驗(yàn)，此模型具有極高顯著性與可靠性(P值＜0.001)，且線性和二次項(xiàng)均顯著，說(shuō)明擬合的二次回歸方程合適，且該方程的決定系數(shù)為R2=0.9486，表明僅有不足6%的總方差不能被該模型概括，說(shuō)明模型的顯著性令人滿意。因此，該模型可以用于復(fù)合菌群降解制漿造紙廢水的分析和預(yù)測(cè)。

表7 響應(yīng)面法分析中的方差分析結(jié)果

2.4 響應(yīng)面法分析與最佳復(fù)合菌群構(gòu)建的確定

響應(yīng)面圖可以預(yù)測(cè)不同檢測(cè)變量水平下COD的去除率，等高線圖可以用于鑒定變量之間的交互作用類型。由二次多項(xiàng)式方程可知，在所有交互作用中，X1X6(P 值 =0.049＜0.05)和 X4X6(P 值 =0.04＜0.05)對(duì)COD的降解表現(xiàn)為較強(qiáng)的顯著性。根據(jù)回歸方程利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Matlab繪出交互項(xiàng)X1X6和X4X6的響應(yīng)面及其等高線圖(見(jiàn)圖1)。由圖1可知，X1(B)X6(PE-9)和X4(Pp)X6(PE-9)的等高線圖為橢圓形，說(shuō)明二者的交互作用對(duì)COD去除有顯著影響，這與統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果相一致。X1(B)X6(PE-9)和X4(Pp)X6(PE-9)的響應(yīng)面圖呈凸面狀，由此可以認(rèn)為它們的細(xì)胞濃度最優(yōu)值是可以確定的。

在獲得回歸非線性模型和響應(yīng)面之后，為了求得最佳復(fù)合菌群組合，所得的回歸方程分別對(duì)各自的變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為0，得到四元一次方程組，求解此方程組可以得出模型的極值點(diǎn)X1=0.3、X4=0.46、X6=0.34、X9=0.38，即細(xì)胞濃度分別為B(0.35)、Pp(0.38)、PE-9(0.41)、Xz6-1(0.35)。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證二次回歸模型的準(zhǔn)確性和有效性，根據(jù)最佳復(fù)合菌群配方對(duì)回歸模型進(jìn)行廢水COD去除率的驗(yàn)證。在最優(yōu)菌群組合 B(0.35)、E(0.2)、G(0.3)、Pp(0.38)、PB-3(0.3)、PE-9(0.41)、PG-1(0.2)、Ppp-3(0.3)和 Xz6-1(0.35)條件下，模型對(duì)制漿造紙廢水COD去除率的預(yù)測(cè)值為86.9%，為驗(yàn)證這一結(jié)果，采用優(yōu)化的細(xì)胞濃度進(jìn)行試驗(yàn)，獲得的COD去除率為(85.7±0.5)%，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值較接近，說(shuō)明運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建復(fù)合菌群是可行的。

圖1 B和PE-9、Pp和PE-9的響應(yīng)面及等高線圖

3 結(jié)語(yǔ)

優(yōu)勢(shì)復(fù)合菌群不是單一的微生物菌種，而是由兩種或者兩種以上的微生物共同培養(yǎng)、相互作用、相互影響，最終達(dá)到發(fā)揮其最大菌群優(yōu)勢(shì)的微生態(tài)系統(tǒng)，因此，它往往比一般的微生物功能更多，處理效果更加明顯，應(yīng)用更具有實(shí)際意義，且運(yùn)行及維護(hù)也比較方便。

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)得出了對(duì)制漿造紙廢水降解有顯著影響的4株菌種，其影響力順序?yàn)锽acillus sp.＞PE-9＞Pseudomonas putida＞Xz6-1，說(shuō)明融合菌的降解效果不一定強(qiáng)于細(xì)菌菌種，但與其親本細(xì)菌相比，融合菌降解效果有明顯改善［10～11］。在最陡爬坡法實(shí)驗(yàn)中，顯著菌株菌懸液濃度為Bacillus sp.(0.34)、Pseudomonas putida(0.37)、PE-9(0.40)和Xz6-1(0.34)時(shí)，制漿造紙廢水COD去除率最大，進(jìn)一步提高細(xì)胞濃度，COD去除率不再提高，說(shuō)明復(fù)合菌群降解是相互作用、相互影響協(xié)同作用的，微生物降解體外物質(zhì)有殘留閾值的限制，增加菌種量不一定能提高降解效果。響應(yīng)面法分析得出的最優(yōu)菌株組合為 Bacillus sp.(0.35)、Enterobacter Cloacae(0.2)、Gordonia sp.(0.3)、Pseudomonas putida(0.38)、PB-3(0.3)、PE-9(0.41)、PG-1(0.2)、Ppp-3(0.3)和 Xz6-1(0.35)，該條件下制漿造紙廢水的降解效果最好，較初始復(fù)合菌群的處理效果有一定提高。這些工作說(shuō)明原生質(zhì)體融合技術(shù)在廢水處理中是一項(xiàng)較有前景的生物技術(shù)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建處理廢水的高效復(fù)合菌群具有可行性。

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