宋光桃 , 周國英

拮抗鏈霉菌F10抗油茶炭疽病菌抑菌機理的研究

宋光桃1，2, 周國英1

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙410004；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽421005)

拮抗鏈霉菌菌株 F10 對油茶炭疽病菌有良好的拮抗效果。為了進一步開發(fā)利用菌株F10，以油茶炭疽病菌為指標(biāo)，研究了菌株F10對油茶炭疽病菌的抑菌機理。結(jié)果表明，菌株F10 能影響菌絲正常生長和分生孢子的萌發(fā)，菌絲出現(xiàn)節(jié)間變短、變粗、扭曲變形、菌絲嚴(yán)重交聯(lián)、細胞質(zhì)聚集、外溢等現(xiàn)象；能分泌蛋白酶和纖維素酶影響油茶炭疽病菌的細胞壁；并對水稻、蠶豆、白菜種子的萌發(fā)有促生作用。

拮抗鏈霉菌F10；油茶炭疽病菌；抑菌機理

拮抗微生物的抑菌機理主要有產(chǎn)生拮抗物質(zhì)、重寄生作用、交叉保護作用、竟?fàn)幾饔煤驼T導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等。闡明拮抗微生物的抑菌機理，對了解拮抗微生物的特性和病害的致病原因，以及確定拮抗微生物能否可在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用，都是十分必要的。放線菌種類繁多，是一類有著廣泛實際用途的資源微生物。目前用在植物病害生物防治中的放線菌主要是鏈霉菌屬及其相關(guān)類群[1-2]。拮抗放線菌主要通過以下兩種途徑對病原菌進行干擾和抑制：一是寄生在植物組織體內(nèi)，誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗病性或代謝出一些具有抑菌作用的活性物質(zhì)（抗生素）影響病原菌的新陳代謝過程，從而達到防病治病的目的[3]；二是在寄主體外利用。

1 材料與方法

1.1 材料

微生物之間的競爭作用、重寄生作用、捕食作用等方式降低病原菌的致病性[4]。本試驗研究了拮抗鏈霉菌F10對油茶炭疽病菌的抑菌機理，為鏈霉菌F10的田間防治油茶炭疽病提供理論依據(jù)。

1.1.1 供試菌株

拮抗鏈霉菌菌株F10，從植物根際土壤中分離篩選[5]。

指示菌株：油茶炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides，由中南林業(yè)科技大學(xué)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基，用于活化菌株F10，不加瓊脂為高氏1號培養(yǎng)液，用于菌株F10的液體培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基，用于病原菌培養(yǎng)、保存和對峙實驗。不加瓊脂為PDA培養(yǎng)液，用于病原菌孢子懸液制備；酪素培養(yǎng)基（牛肉膏 0.3 g, 酪素1. 0 g, NaCl 0.5 g,瓊 脂 18g, pH 7.6-8.0, H2O 1 000 mL）， 用于菌株F10產(chǎn)蛋白酶能力測定；羧甲基纖維素培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉5.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g,(NH4)2SO40.5 g, K2HPO40.25 g,瓊脂18 g, H2O 1 000 mL），用于菌株F10 產(chǎn)纖維素酶能力測定；葡聚糖培養(yǎng)基（葡聚糖3 g，NaNO30.3 g，K2HPO40.1 g，KCl 0.05 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，瓊脂2 g，蒸餾水 100 mL），用于菌株F10產(chǎn)葡聚糖酶能力測定。

1.1.3 供試溶液

0.1 % 剛果紅染色液；1 mol/L NaCl 溶液；1 %NaOH 溶液；1 % HCl 溶液。

1.1.4 供試種子

水稻、小麥、蠶豆、莧菜、白菜、辣椒（購于種子公司）。

1.2 方法

1.2.1 油茶炭疽病菌孢子懸浮液制備

將油茶炭疽病菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板上，30℃下培養(yǎng) 7 d，加入無菌水從平板上洗脫孢子，以 4 層滅菌紗布過濾制成孢子懸浮液，備用。

1.2.2 拮抗鏈霉菌F10無菌濾液制備

將活化拮抗鏈霉菌F10 接入裝有 100 mL 高氏1 號培養(yǎng)液的 250 mL 的三角瓶中，30℃、140 r/min下振蕩培養(yǎng) 5 d，得發(fā)酵液，將部分發(fā)酵液用 0.22μL 的無菌微孔濾膜過濾得無菌濾液，將發(fā)酵液和無菌濾液置 4℃ 下保存，備用。

1.2.3 拮抗鏈霉菌F10對病原菌菌絲形態(tài)的影響

取直徑為6 mm的油茶炭疽病菌菌餅1個接于PDA培養(yǎng)基平板一側(cè)，另一側(cè)接種拮抗鏈霉菌F10菌餅（直徑為6 mm）1個，30℃ 下培養(yǎng)6 d，挑取病原菌的菌落邊緣的菌絲在顯微鏡下觀察并照相，以只接油茶炭疽病菌作對照，重復(fù) 3 次。

1.2.4 拮抗鏈霉菌F10對病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

采用凹玻片法：取無菌凹玻片，先加入 1 %葡萄糖無菌液 10 μL、再加入油茶炭疽病菌的孢子懸浮液 20 μL、最后加入拮抗鏈霉菌F10 的發(fā)酵液或無菌濾液 20 μL，蓋上蓋玻片，放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中于30℃ 下培養(yǎng) 24 h 后檢查孢子的萌發(fā)情況（當(dāng)孢子芽管長度大于孢子的短半徑時即視為萌發(fā)），記錄孢子萌發(fā)率和芽管長度。每個樣品設(shè) 3 個平行，重復(fù) 3 次，用無菌水 20 μL 代替發(fā)酵液或無菌濾液作為空白對照(CK)。

1.2.5 拮抗鏈霉菌F10產(chǎn)真菌細胞壁水解酶能力測定

1.2.5.1 產(chǎn)蛋白酶能力測定

將活化鏈霉菌F10菌餅（直徑為6 mm）接到酪素培養(yǎng)基平板上，每個平板接 3 個菌餅，在30℃下培養(yǎng)3 d。重復(fù)3 次。觀察菌落外圍有無透明圈出現(xiàn)。若有清晰的透明圈出現(xiàn)，則證明該菌株可以產(chǎn)蛋白酶。反之，則不產(chǎn)蛋白酶。

1.2.5.2 產(chǎn)纖維酶能力測定

按1.2.5.1方法，將鏈霉菌F10接到羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上，30℃下培養(yǎng)3 d。后用0.1%的剛果紅染色液浸染10 min，再用1 mol/L的NaCl 溶液脫色5 min。觀察菌落外圍有無透明圈出現(xiàn)。若有清晰的透明圈出現(xiàn)，則證明該菌株可以產(chǎn)纖維素酶，反之，則不產(chǎn)纖維素酶。

1.2.5.3 產(chǎn)葡聚糖酶能力測定

按1.2.5.1方法，將鏈霉菌F10菌餅接到葡聚糖培養(yǎng)基平板上30℃下培養(yǎng)3 d。用0.1% 的剛果紅染色液浸染30 min，再用1 mol/L的NaCl 溶液脫色5 min。觀察菌落外圍有無透明圈出現(xiàn)。若有清晰的透明圈出現(xiàn)，則證明該菌株可以產(chǎn)葡聚糖酶，反之，則不產(chǎn)葡聚糖酶。

1.2.6 拮抗鏈霉菌F10對種子萌發(fā)的影響測定

將供試種子用自來水沖洗干凈，70% 的酒精浸泡1 min，再用0.1% 的升汞浸泡1 min 進行表面消毒處理，用無菌水沖洗 3～4 次，備用。在直徑為 9 cm 和 18 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上濾紙，經(jīng)滅菌冷卻后，加入鏈霉菌F10 的發(fā)酵液，以滅菌自來水為對照，每皿中放置種子 10 粒，其中大粒蠶豆種子放置于直徑為18 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，其余種子放置于直徑為 9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，每處理 3 個重復(fù)，在 28℃ 下培養(yǎng) 7 d 后觀察其是否生長，測定種子的根長和芽長，并計算種子發(fā)芽率。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗鏈霉菌F10對病原菌菌絲形態(tài)的影響結(jié)果

拮抗鏈霉菌F10對油茶炭疽病菌的菌絲有明顯的致畸作用，在靠近菌株F10 的邊緣處，病原菌的菌絲不向外擴展生長，形成明顯的灰黑色抑菌條帶。鏡檢觀察可看出受拮抗菌株F10 影響的油茶炭疽病菌的菌絲生長畸形，菌絲出現(xiàn)節(jié)間變短、變粗、扭曲變形、菌絲嚴(yán)重交聯(lián)、細胞質(zhì)聚集、外溢等現(xiàn)象。而正常生長的病原菌菌絲呈現(xiàn)出細、直，菌絲之間無交聯(lián)（見圖1）。

圖1 菌株F10 對油茶炭疽病菌菌絲的影響Fig. 1 Effect of strain F10 on hyphae of C. gloeosporioides A:畸形菌絲, B: 菌絲交聯(lián), C:正常菌絲

2.2 拮抗鏈霉菌F10對病原菌分生孢子萌發(fā)的影響結(jié)果

拮抗鏈霉菌F10對油茶炭疽病菌的分生孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。其發(fā)酵液與無菌濾液對分生孢子萌發(fā)的抑制率分別為 92.3% 和 84.5%。

2.3 拮抗鏈霉菌F10產(chǎn)真菌細胞壁水解酶能力測定結(jié)果

2.3.1 產(chǎn)蛋白酶能力測定結(jié)果

將拮抗鏈霉菌F10 的菌餅接到酪素培養(yǎng)基平板上生長3 d 后，其菌餅周圍形成了透明水解圈，其寬度為 5 mm，表明拮抗鏈霉菌F10在生長的過程中代謝產(chǎn)生了蛋白酶，它們分解了培養(yǎng)基中的酪蛋白，使菌餅周圍出現(xiàn)透明圈(見圖2)。

2.3.2 產(chǎn)纖維素酶能力測定結(jié)果

將拮抗鏈霉菌F10的菌餅接到羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上生長3 d 后，先用剛果紅染色液染色，再用NaCl 溶液脫色，發(fā)現(xiàn)其菌餅周圍出現(xiàn)淺紅色的水解圈，其寬度為3.5 mm，說明拮抗鏈霉菌F10 能夠產(chǎn)生纖維素酶(見圖2)。

圖2 菌株F10在酪素培養(yǎng)基（左）和羧甲基纖維素培養(yǎng)基（右）上的菌落形態(tài)Fig. 2 Colony morphology of strain F10 on easein medium(left) and CMC medium(right)

2.3.3 產(chǎn)葡聚糖酶能力測定結(jié)果

將拮抗鏈霉菌F10 的菌餅接到葡聚糖培養(yǎng)基平板上生長3 d 后，先用剛果紅染色液染色，再用NaCl 溶液脫色，發(fā)現(xiàn)其菌餅周圍不出現(xiàn)淺紅色的水解圈，說明拮抗鏈霉菌F10不產(chǎn)生葡聚糖酶。

2.3.4 拮抗鏈霉菌F10對種子萌發(fā)的影響測定結(jié)果

拮抗鏈霉菌F10 對供試種子萌發(fā)的影響結(jié)果見表1。

由表1可知，菌株F10 對供試種子的影響是不同的，對水稻、白菜、蠶豆的種子與對照相比，其根要長些，發(fā)芽率要高一些，特別是對白菜種子，長勢好于對照，可能是對其有促生作用；但辣椒種子長勢差些，特別是根，可能有抑制作用；其它種子與對照相比相差不大，無明顯的促進或抑制生長的表現(xiàn)。

表1 菌株F10 和菌株CF17 對種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of strain F10 and strain CF17 (CK) on germination of seeds

3 結(jié)論與討論

不同拮抗微生物的抑菌機理是不同的，有的是一種抑菌機理起主要作用，如眾多的酵母菌和類酵母菌，其競爭作用占有重要地位[6],并認為是拮抗酵母菌的主要作用方式。有的是幾種抑菌機理綜合作用的結(jié)果，如王革等[7]發(fā)現(xiàn)綠色木霉Tv21 的菌絲生長迅速，能附著、纏繞于煙草赤星病病原菌菌絲上，并產(chǎn)生吸器侵入菌絲；同時還能分泌使病原菌菌絲原生質(zhì)濃縮、斷裂、消解的物質(zhì)。本試驗證實拮抗鏈霉菌F10能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)影響油茶炭疽病菌的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，同時能分泌蛋白酶和纖維素酶水解油茶炭疽病菌的細胞壁，致使病原菌的細胞質(zhì)聚集、外溢等。在測度供試種子時，對白菜等種子有促進生長的作用。另外，由前期試驗[5]可知，用拮抗鏈霉菌F10的發(fā)酵液混菌接種后再接油茶炭疽病菌的菌餅，結(jié)果該病原菌完全被抑制，說明拮抗鏈霉菌F10 生長快，迅速占據(jù)了培養(yǎng)皿的空間和大部分營養(yǎng)，使病原菌的生長受到抑制，因而具有競爭作用。綜合起來，拮抗鏈霉菌F10可以通過分泌抗菌活性物質(zhì)（抗生素）、產(chǎn)生水解酶（蛋白酶和纖維素酶）以及競爭作用等抑菌機理來抑制油茶炭疽病菌的生長，從而達到防治油茶炭疽病的效果，至于拮抗鏈霉菌F10 是否還具有誘導(dǎo)油茶產(chǎn)生抗病性還有待進一步研究。

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Study on inhibitory mechanism of antagonistic streptomyces F10 to Colletotrichum gloeosporioide

SONG Guang-tao1,2, ZHOU Guo-ying1
(1.Central South University of Forestry & Technology,Changsha Hunan 410004;2. Hunan Environment-Biologic Polytechnic, Hengyang Hunan 421005)

Antagonistic streptomyces strain F10 has good antagonistic activity to Colletotrichum gloeosporioides. In order to development and utilization strain F10, by taking the antimicrobial activity for C. gloeosporioides as the indicator, the inhibitory mechanism of strain F10 to C. gloeosporioides has been studied. The results show that the strain F10 could affect the growth of mycelia and conidia germination of C. gloeosporioides, resulting in shortening and thickening, twisting and deforming, serious cross linking the internode of mycelia, aggregating cytoplasmic and the leak of cytoplasm; the strain F10 could secrete protease and cellulose to affect cell wall of C. gloeosporioides, and which could promote seed germination of rice, broad bean and Chinese cabbage.

antagonistic streptomyces F10; C. gloeosporioides; inhibitory mechanism

S794.4；S718.85

A

1673-923X(2012)08-0090-04

2012-02-12

國家“十一五”林業(yè)支撐計劃項目（2009BADB1B0204）；林業(yè)公益行業(yè)科研專項項目（2011-05）

宋光桃（1965—），女，湖南衡南人，副教授，主要從事森林保護及微生物的教學(xué)與科研工作

周國英（1966—），女，湖北應(yīng)城人，博士, 教授，博士生導(dǎo)師，主要從事森林保護教學(xué)與科研

[本文編校:邱德勇]