崔魯佳 阮 巖李嬋娟 秦麗娜

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.中山大學，廣東 廣州 510275；3.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100020）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）在耳鼻咽喉科是一種常見病，是由致敏原引起體內變化而引起的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病，主要的臨床表現(xiàn)有鼻塞、流鼻涕、鼻癢、打噴嚏，以及嗅覺功能障礙等,近年來隨著工業(yè)化程度的發(fā)展，生態(tài)環(huán)境的惡化，AR的患病率在全球有增長的趨勢，據(jù)國外統(tǒng)計，其發(fā)病率為10%～40%。變應性鼻炎已成為全球性健康問題。目前已用于變應性鼻炎造模的實驗動物種類繁多，所選動物有豚鼠、大鼠、小鼠及新西蘭兔等。本實驗使用卵清蛋白誘發(fā)C57小鼠建立變應性鼻炎動物模型，對其癥狀學、病理生理學進行觀察，并對IL-4、IFN-γ水平進行檢測，為該病的臨床研究提供依據(jù)。

材料與方法

1.材料

(1)實驗動物：采用清潔級、8周齡雄性C57BL6系統(tǒng)小鼠，體重在16-20g左右，共24只，購于廣東省實驗動物中心。在空調動物房飼養(yǎng)，自由飲水，恒溫恒濕的環(huán)境下，SPF級固體飼料，適應性飼養(yǎng)7天后開始正式實驗。24只小鼠隨機分為2組：實驗組、對照組，每組12只。另有2只體重250-300g的SD大鼠（購于廣東省實驗動物中心），飼養(yǎng)條件相同，避免接觸過敏原，被動皮膚過敏反應(passivecutaneous anaphylaxis reaction，PCA)備用。

(2)主要試劑：致敏原為卵清蛋白(OVA)，購自上海歐韋達儀器科技有限公司（日本和光純藥工業(yè)株式會社生產）；佐劑為氫氧化鋁(上海化工試劑總廠)。IL-4、IFN-γ 的 ELISA試劑盒均購置美國R&D公司。

2.AR模型的建立：

(1)致敏：實驗組小鼠用OVA 10ug、AI(OH)2mg加入生理鹽水0.1ml比例制成混懸液，自第0天開始腹腔注射，隔天1次，共7次。對照組用生理鹽水代替同法注射。

（2）激發(fā)：PCA試驗成功后，以 OVA 1g：生理鹽水10ml溶液，用微量加樣器，每側鼻腔4ul激發(fā)，每1d激發(fā)1次，連續(xù)激發(fā)7次。對照組以生理鹽水代替卵白蛋白滴鼻。

3.觀察項目：

（1）癥狀學觀察：從造模第1天開始觀察動物行為、狀態(tài)、體征、攝食、飲水、大小便性狀、體溫、體質量等，并在每次鼻腔致敏后，觀察記錄10min內小鼠鼻清涕量、噴嚏及搔鼻次數(shù)，采用疊加法計算總分，總分大于5分為模型成功。

（2）PCA反應實驗：

在基礎致敏完成后第2天，從各組中隨機取4只小鼠，取眼底靜脈采血0.3ml，將血液離心，取血清40ul并用生理鹽水按1：4，1：16，1：64，1：256 的比例進行稀釋，取備用的 2只SD大鼠，背部毛剃掉，用紅色油筆在背部劃數(shù)個直徑為1.5cm的圓圈，間隔2cm，將不同濃度的血清各0.1ml在圓圈內皮下注射，48h后，將伊文斯藍10mg，OVA2mg溶解于1ml生理鹽水中，并注射于大鼠的股靜脈里，半小時后處死大鼠，觀察背部皮膚，測量藍斑直徑，若注射血清部位出現(xiàn)藍斑，且直徑大于5mm判定為陽性反應。證明有OVA特異性抗體，造模成功。

（3）測定細胞因子 IL-4、IFN-r：

末次激發(fā)12h內，腹腔注射水合氯醛麻醉，摘眼球取外周血，并于3000r/min離心收集血清。用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定細胞因子IL-4、IFN-r。具體操作步驟遵照ELISA測定說明書，采用Mod-el550型酶標儀檢測和數(shù)據(jù)采集。

（4）病理學觀察：

采血后，斷頸椎處死小鼠，小心取出取小鼠鼻中隔前中部粘膜，用4%多聚甲醛緩沖液固定、5%甲酸脫鈣，經脫水包埋、切片、HE染色，高倍鏡下觀察肥大細胞、嗜酸性白細胞、嗜堿性白細胞的浸潤情況。

4.統(tǒng)計分析

采用SPSS 16·0統(tǒng)計軟件包，分析研究實驗前后動物癥狀的變化及各項理化指標，全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，以P0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.癥狀評分：

實驗組12只動物在激發(fā)后，小鼠頻頻用前爪抓鼻端兩側，并伴有噴嚏聲，清水鼻涕較多，評分都大于5分，造模成功。對照組僅輕度抓鼻，且噴嚏少，無流涕，評分均小于5分，造模未成功。且對照組的抓鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)在激發(fā)后10分鐘內顯著低于實驗組的次數(shù)(P<0.01)。

2.PCA實驗結果通過

PCA實驗發(fā)現(xiàn)，以實驗組小鼠血清接種的SD大鼠背部均出現(xiàn)藍圈，直徑在4-7 mm，而對照組僅見紅斑或藍點，基本上無藍圈反應，說明實驗組小鼠血清中IgE效價較高。

3.測定細胞因子 IL-4、IFN-r：

IL-4含量實驗組和對照組分別為（18.64±9.5）pg/ml、（8.26±4.50）pg/ml，IFN-r含量實驗組和對照組分別為（10.28±8.5）pg/ml、（4.63±6.8）pg/ml，實驗組 IL-4 和 IFN-r含量與對照組之間有顯著性差異(P<0.01)，顯著高于對照組。

4.病理學結果

模型組鼻黏膜下組織間質水腫，小血管擴張，血管內及組織固有層內可見以嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤。對照組動物鼻黏膜上皮結構完整，排列均勻，黏膜下層未見組織間隙水腫和血管充血，僅見少量炎癥細胞浸潤。

討論

本實驗采用腹腔注射和滴鼻激發(fā)的方法，可較好地保證模型局限于變應性鼻炎的表現(xiàn)。根據(jù)癥狀評分，PCA反應陽性以及病理學顯示以嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，證明選用C57小鼠可以成功建立變態(tài)反應模型，且相對于其他動物，C57小鼠的費用低，可以大大降低實驗的費用。

末次激發(fā)12h內外周血淋巴細胞產生的細胞因子IL-4和INF-γ均高于正常對照組，說明IL-4和INF-γ在AR炎癥發(fā)生中起重要作用，符合人類變應性鼻炎的發(fā)病過程，但人類變應性鼻炎INF-γ存在時相性變化，所以本實驗仍有不足之處，需進一步改進，但本實驗造模方法仍是可行的。

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