陳尚衛(wèi) 戴 軍 吳勝芳 虞銳鵬 朱 松

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

富硒酵母中硒蛋氨酸的GC－MS/MS測定

陳尚衛(wèi) 戴 軍 吳勝芳 虞銳鵬 朱 松

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

建立酵母中硒蛋氨酸含量的氣相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法（GC－MS/MS）分析方法。比較3種富硒酵母中硒蛋氨酸檢測樣品的提取方法，優(yōu)化硒蛋氨酸的酶解提取條件；以氯甲酸乙酯為衍生化試劑，2－氯苯丙氨酸為內(nèi)標(biāo)物，采用選擇離子模式對衍生物進(jìn)行GC/MS/MS檢測。結(jié)果表明，硒蛋氨酸的回收率為90.0%～97.0%，檢測限為4μg/L，方法精密度（RSD）為7.8%。該方法簡單快捷、定量準(zhǔn)確、靈敏度高。

富硒酵母；硒蛋氨酸；四級桿串聯(lián)質(zhì)譜

硒（selenium，Se）是生物體必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗衰老、促進(jìn)免疫及解毒等諸多生理活性。人體一旦缺硒就會引起一些重要器官的功能失調(diào)，導(dǎo)致許多嚴(yán)重疾病發(fā)生，動物缺硒會導(dǎo)致白肌病和生長緩慢等［1－3］。有研究［4，5］表明：無機(jī)硒生物活性、利用率較低，不易被腸道吸收，還具有一定毒性，攝入過量會導(dǎo)致急、慢性中毒。有機(jī)硒是生物體通過代謝過程將環(huán)境中的無機(jī)硒通過與體內(nèi)的生物大分子相結(jié)合形成含硒有機(jī)物。有機(jī)硒補(bǔ)劑特別是富含硒代氨基酸的產(chǎn)品在毒理安全性、生理活性和吸收率上更具有優(yōu)越性，而富含有機(jī)硒的富硒酵母是人與動物常見的補(bǔ)硒產(chǎn)品。硒蛋氨酸是富硒酵母中硒的主要存在形態(tài)［5，6］。

目前，硒蛋氨酸的分析檢測方法主要有：液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LC－ICP/MS）［7］、液相色譜－氫化物發(fā)生原子熒光光譜法［8，9］、氣相色譜－氫火焰離子檢測法［10］、氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［11］、液相色譜－電噴霧質(zhì)譜法［12］、離子色譜法等［13］。但這些方法有些樣品預(yù)處理繁瑣，且基質(zhì)干擾多，影響定性定量結(jié)果；有些儀器普及不高。目前中國針對富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測報道較少，許多廠家不得不送樣品至國外檢測。本試驗比較了3種富硒酵母中硒蛋氨酸的提取方法，建立了富硒酵母中硒蛋氨酸的GC－MS/MS測定方法，為酵母中硒蛋氨酸的檢測提供一個新的方法選項。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超聲波清洗器：KQ250DB，昆山超聲波儀器有限公司；

多用途水浴恒溫振蕩器：DSHZ－300，江蘇太倉實驗設(shè)備廠；

臺式離心機(jī)：Anke TGL－16C，上海安亭科學(xué)儀器廠；

電熱恒溫水浴鍋：HHS，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：1200LGC－MS/MS，美國瓦里安公司；

三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、鹽酸、乙醇、氯仿、吡啶：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

氯甲酸乙酯：≥98%，瑞士Fluka公司；

2－氯苯丙氨酸：≥99%，上海翰鴻化工科技有限公司；

復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；

富硒酵母（樣品A）：安琪酵母股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母中硒蛋氨酸的提取［11］

（1）超聲波提?。嚎疾觳煌軇μ崛∥鞍彼岬挠绊憽Ｓ貌煌娜軇┤芙鈽悠?，然后進(jìn)行超聲波處理。稱取200mg左右樣品A于25mL容量瓶中，加溶劑（水或0.1mol/L Tris緩沖液或0.1mol/L HCl等）溶解，定容后置于超聲波中，在50℃下超聲30min，離心過濾，濾液備用。

（2）酸解法提?。嚎疾觳煌瑵舛塞}酸對提取硒蛋氨酸的影響。稱取200mg左右樣品A于水解管中，分別加不同濃度的 HCl（0.1，0.4，2，4，6mol/L）10mL，充 N2后封 管，于50℃水浴中水解10h，冷卻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7，并用水定容至50mL，離心過濾，濾液備用。

（3）蛋白酶水解：考察不同的蛋白酶對提取硒蛋氨酸的影響。稱取200mg左右樣品A于10mL三角瓶中，加入一定量的蛋白酶，加入10mL 0.1mol/L的Tris緩沖溶液（pH 8.0），在55℃水浴搖床上反應(yīng)24h，然后以10 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，移取上清液，用0.45μm醋酸纖維薄膜過濾，濾液備用。

1.2.2 硒氨酸的衍生化［14］取硒蛋氨酸標(biāo)樣溶液（1～10μg/mL）200μL至衍生化小瓶中，加入5μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液200μL、乙醇200μL、吡啶50μL，充分搖勻，再加入氯甲酸乙酯（ECF）50μL充分搖勻，直至無氣泡冒出。加入1%ECF氯仿500μL充分振蕩，靜置。取氯仿相200μL進(jìn)樣。樣品的衍生化方法與標(biāo)樣相同。

1.2.3 GC－MS/MS分析條件［14］

（1） 色 譜 條 件：色 譜 柱 DB－5（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比10∶1；載氣為 He氣，恒流模式，流速1.0mL/min；程序升溫，120 ℃保持1min再以15℃/min升到280℃保持5min；傳輸線溫度250℃，進(jìn)樣量1μL。

（2）質(zhì)譜條件：EI源，電離能70eV，離子源溫度200℃，溶劑延遲3min，掃描方式：選擇離子監(jiān)測（SRM），檢測器電壓1 200V。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母中硒蛋氨酸提取方法的選擇

Beril Iscioglu等［15］分別試驗了水、0.1mol/LTris緩沖液、0.1mol/L HCl在50℃下超聲提取酵母中硒蛋氨酸，結(jié)果表明超聲對酵母中硒蛋氨酸有一定的提取效果。本試驗也比較了水、0.1mol/L Tris 緩沖液 （pH 8）、0.1mol/L HCl、0.4mol/L HCl、2mol/L HCl、4mol/L HCl提取溶劑按1.2.1方法超聲波提取，測得樣品A硒蛋氨酸含量范圍為52～112μg/g，其結(jié)果比其他方法低許多，可能是由于富硒酵母中硒蛋氨酸主要以含硒蛋氨酸的蛋白形態(tài)存在，而超聲不能使其蛋白充分水解，使硒蛋氨酸不能完全游離出來。

酸解法試驗了0.1 ，0.4，2，4，6mol/L HCl和水解4，10，20，50h對硒蛋氨酸含量的影響，測得樣品A硒蛋氨酸含量范圍為216～564μg/g，可看出酸解法提取優(yōu)于超聲波提取，但由于硒蛋氨酸不太穩(wěn)定，酸解會破壞硒蛋氨酸的結(jié)構(gòu)，因此酸解法測得硒蛋氨酸的含量也不是很高。試驗中加入巰基乙醇保護(hù)劑對結(jié)果也沒有明顯提高。

文獻(xiàn)［11］認(rèn)為酶解法效果優(yōu)于酸解法，而且酶解試驗條件溫和對硒蛋氨酸破壞較小。本試驗比較了胰蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶以及堿性蛋白酶在不同條件下對富硒酵母的酶解效果，測得樣品A硒蛋氨酸的含量范圍為556～1 764μg/g。由表1可知，酶解法提取優(yōu)于超聲及酸解法提取，這幾種酶中以堿性蛋白酶酶解效果最好，測得硒蛋氨酸的含量最高。

表1 不同提取方法測得富硒酵母中硒蛋氨酸的含量Table 1 Content of selenomethionine detected by different extraction methods in selenium－enriched yeast

2.2 堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化

影響酶解效果的因素主要有pH值、溫度、反應(yīng)時間、酶用量和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。試驗中以此確定正交試驗因素水平，以L9（34）進(jìn)行試驗。

表2 正交因素水平表Table 2 Orthogonal factors and levels

由表2可知，四因素對酶解效果的影響順序為B＞A＞C＞D，最佳反應(yīng)條件為A2B3C1D2。在最佳條件下硒蛋氨酸的含量可達(dá)到1 898μg/g。

2.3 衍生化條件的選擇

樣品的衍生化處理一般要求發(fā)生反應(yīng)容易、操作簡便，而氯甲酸乙酯與氨基酸中的基團(tuán)在溶液中易發(fā)生親核加成反應(yīng)，反應(yīng)完全且反應(yīng)速度較快、基本無副產(chǎn)物生成，是較理想的衍生化反應(yīng)。而且反應(yīng)的衍生化產(chǎn)物極性與沸點適于氣相色譜分析。本試驗中在室溫下漩渦振蕩反應(yīng)30s即可使反應(yīng)完全。

2.4 內(nèi)標(biāo)物及質(zhì)譜條件的選擇

由于GC－MS/MS在定量中，用外標(biāo)法定量可能會有較大的誤差，因此試驗中采用內(nèi)標(biāo)法定量。本試驗中選擇了2－氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)物，2－氯苯丙氨酸為人工合成品，自然界沒有，且離子化效果好，和硒蛋氨酸能很好的分離，是硒蛋氨酸GC－MS/MS分析中較理想的內(nèi)標(biāo)物。

試驗中選擇m/z 202，128作為硒蛋氨酸衍生產(chǎn)物的子離子，m/z 153.9，181.5為內(nèi)標(biāo)衍生物的子離子進(jìn)行監(jiān)測，通過比較得到m/z 202，153.9分別作為硒蛋氨酸及內(nèi)標(biāo)物的衍生產(chǎn)物的子離子檢測具有更高的選擇性及靈敏度，因此選擇了m/z 202，153.9分別作為硒蛋氨酸及內(nèi)標(biāo)物的衍生產(chǎn)物的子離子進(jìn)行檢測。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experimental

2.5 硒蛋氨酸的線性范圍和檢出限

分別用1，2，5，10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)樣1μL，測得硒蛋氨酸在1～10μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。以3倍信噪比作為檢測限，計算得硒蛋氨酸的檢測限（LOD）為4μg/L。

對同一樣品進(jìn)行5次重復(fù)進(jìn)樣得出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.7%。對同一樣品進(jìn)行5個平行試驗，均在同一條件下提取和衍生化，得到本方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為7.8%。對同一樣品稱取200mg酵母分別加入100，250，500μg硒蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別酶解和衍生處理，測得回收率分別為90.0%，94.2%，97.1%。

圖1 硒蛋氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of selenomethionine

2.7 富硒酵母樣品中硒蛋氨酸的檢測

選取市場上5個富硒酵母樣品按所建立的方法進(jìn)行了測定，結(jié)果見表3。標(biāo)樣及樣品圖見圖2、圖3。

表4 樣品中硒蛋氨酸檢測結(jié)果Table 4 Determination results of selenomethionine in selenium－enriched yeast

圖2 硒蛋氨酸標(biāo)樣及內(nèi)標(biāo)的多離子監(jiān)測色譜圖Figure 2 Chromatogram of selenomethionine and internal standard with multiple ions reaction monitoring mode

圖3 富硒酵母中硒蛋氨酸及內(nèi)標(biāo)的多離子監(jiān)測色譜圖Figure 3 Chromatogram of selenomethionine and internal standard with multiple ions reaction monitoring mode in selenium－enriched yeast

3 結(jié)論

比較了富硒酵母中硒蛋氨酸的樣品提取方法，優(yōu)化了酶解法提取富硒酵母中硒蛋氨酸的試驗條件，確定的酶解法處理較簡便，對于酵母中的硒蛋氨酸提取效率高，損失小；本試驗建立的硒蛋氨酸的GC－MS/MS分析方法，樣品衍生簡單快捷、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性較好，靈敏度高，可以作為富硒酵母中硒蛋氨酸測定的一種新的實用可靠的定性定量手段。

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Determination of selenomethionine in selenium－enriched yeast by gas chromatography－tandem quadrupole mass spectrometry

CHEN Shang－wei DAI Jun WU Sheng－fang YU Rui－pengZHU Song

（Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China）

To establish the method of gas chromatography－tandem quadrupole mass spectrometry in order to determine selenomethionine.Three extraction methods were compared for extraction efficiency of selenomethionine from the samples.The extraction conditions of selenomethionine were optimized.The selenomethionine and internal standard（2－chloro－phenylalanine）was derivatives with ethyl chloroformate.The samples were analyzed by GC－MS/MS with internal standard method.Results：The detection limits of selenomethionine were 4ug/L.The recoveries of selenomethionine ranged from 90.0%to 97.0%with RSDs of less than 7.8%.The results obtained indicated that the method was simple，rapid and accurate，and was suitable for the qualitative and quantitative analysis of selenomethionine in selenium－enriched yeast.

selenium－enriched yeast；selenomethionine；tandem quadrupole mass spectrometry

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.015

陳尚衛(wèi)（1978－），男，江南大學(xué)工程師，工程碩士。E－mail：chenshangwei＠yahoo.com.cn

2011－12－25