郭利軍，曾炳山，劉 英，李湘陽，裘珍飛

（中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化巨桉Eg5影響因素的研究

郭利軍，曾炳山，劉 英，李湘陽，裘珍飛

（中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520）

以巨桉無性系Eg5葉片為外植體材料，以GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)作為評價指標(biāo)，主要探討了預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)基pH、共培養(yǎng)時間和乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）對遺傳轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果表明預(yù)培養(yǎng)3 d、菌液濃度OD600nm為0.5、接種30～60 min、共培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0、共培養(yǎng)基中添加150 mg·L-1AS、菌液中不添加AS、共培養(yǎng)1 d遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳，初步建立了巨桉Eg5的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

巨桉；農(nóng)桿菌；Eg5；遺傳轉(zhuǎn)化

Eg5是優(yōu)良的巨桉Euclyptus grandis W.Hill ex Maiden無性系，具有速生、干形通直、分枝角度小、出材率高等特點(diǎn)，在我國江西南部、湖南南部、福建中部等南亞熱帶地區(qū)已廣泛栽培，但巨桉Eg5也存在青枯病抗性較低、抗寒能力不足等問題。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可以將抗病、抗寒等目的基因轉(zhuǎn)入巨桉基因組中，將大大改善上述不良性狀。本文系統(tǒng)研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化巨桉Eg5的多個因素，旨在建立巨桉的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為巨桉的轉(zhuǎn)基因育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以生根培養(yǎng)45 d左右的Eg5無菌生根苗為試驗材料，選取頂端完全展開的1～4片帶葉柄的葉片為外植體，剪去占全葉1/3長度的葉尖部分。

1.2 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

農(nóng)桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，pH 7.0；預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基為改良MS+TDZ0.12 mg·L-1+NAA0.25 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH 5.8；培養(yǎng)基在0.11 MPa壓力下，121℃滅菌17 min后冷卻待用。

1.3 農(nóng)桿菌菌株及質(zhì)粒

菌株為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的農(nóng)桿菌菌株GV3101含有載體質(zhì)粒pBI121，該質(zhì)粒攜帶有CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTⅡ基因和GUS基因。

1.4 農(nóng)桿菌工程菌液的制備

取-75℃凍存的根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，在冰上解凍后劃平板活化培養(yǎng)3 d。挑取單菌落于4 ml液體LB培養(yǎng)基中180 rpm過夜培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm值達(dá)到0.2后，按照1∶40比例接入新鮮LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至所需OD600nm值，4 000 rpm離心8 min，再用等量的液體再生培養(yǎng)基重懸菌體備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 基本轉(zhuǎn)化條件

農(nóng)桿菌采用GV3101，將修剪好的葉片外植體于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3 d，菌液濃度OD600nm值0.5時侵染10 min，取出外植體于黑暗條件下共培養(yǎng)2 d。采用逐步優(yōu)化的方法進(jìn)行試驗，每一步驟得到的結(jié)果將應(yīng)用到下一步的轉(zhuǎn)化實驗中[1]。

1.3.2 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

預(yù)培養(yǎng)時間試驗設(shè)置為0、3、6、9、12、15 d 6種處理；菌液濃度試驗設(shè)置OD600nm值0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 共 8 種 處理；接種時間試驗設(shè)置為10、20、30、40、50、60 min 6 種處理；共培養(yǎng)基pH值試驗設(shè)置為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2共7種處理；菌液中添加乙酰丁香酮試驗設(shè)置為：0、45、90、135、180 mg·L-1共5種處理；共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮試驗設(shè)置為：0、50、100、150、200 mg·L-1共5種處理。

1.3.3 試驗重復(fù)

所有試驗每處理重復(fù)3次，每個重復(fù)外植體20～30個。

1.3.4 GUS染色分析

參照J(rèn)efferson R.A的GUS組織化學(xué)染色法[2]，共培養(yǎng)結(jié)束后對葉片外植體進(jìn)行GUS染色。

1.3.5 轉(zhuǎn)化效果評價指標(biāo)

轉(zhuǎn)化效果的評價指標(biāo)為葉柄GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)。

GUS瞬時表達(dá)率是指葉柄有GUS藍(lán)斑的外植體占總外植體數(shù)的百分率，GUS瞬時表達(dá)率=

瞬時表達(dá)率指數(shù)指葉柄經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后整個葉柄被染色面積大小的程度，瞬時表達(dá)率指數(shù)采用分級計數(shù)法，瞬時表達(dá)率指數(shù)=

各字母代表數(shù)值見表1，分級計數(shù)法具體內(nèi)容可參見方中達(dá)植病研究方法一書[3]。

表1 巨桉Eg5葉柄侵染效果分級Table 1 Grading of infection effect on petiole of E.grandis clone Eg5

1.3.6 統(tǒng)計分析

所有百分?jǐn)?shù)經(jīng)平方根反正弦化ASIN(SQRT(X))、個數(shù)經(jīng)平方根轉(zhuǎn)化SQRT(X)，采用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較（p=0.05）。文中數(shù)據(jù)為未轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)時間

預(yù)培養(yǎng)時間是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化實驗中一個重要的影響因素，侵染前外植體一般要經(jīng)過一段時間的預(yù)培養(yǎng)以促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂，使受體細(xì)胞處于更容易整合外源DNA的狀態(tài)，從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[4]。表2的多重比較結(jié)果顯示，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加，GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，預(yù)培養(yǎng)0 d和3 d，GUS瞬時表達(dá)率維持在40%左右，達(dá)到了最高水平；預(yù)培養(yǎng)3 d，葉片外植體進(jìn)入了最佳的脫分化時間，瞬時表達(dá)率指數(shù)達(dá)到31%，染色效果最佳，顯著優(yōu)于其它水平；超過3 d后，葉片外植體則由脫分化狀態(tài)進(jìn)入了分化狀態(tài)，妨礙了外源基因的整合，所以對于Eg5葉片外植體來說最佳的預(yù)培養(yǎng)時間為3 d。

表2 預(yù)培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 2 Effects of different pre-culture time on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.2 菌液光密度

光密度值是衡量農(nóng)桿菌菌液濃度的最好指標(biāo)[5]，通常以600 nm處菌液的可見光光度值OD600nm代表菌液的濃度進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染實驗。由表3可知，隨著菌液光密度的逐漸增大，GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。OD600nm為0.1時，由于細(xì)菌數(shù)量不足，葉柄部位GUS基因GUS瞬時表達(dá)率為0；OD600nm在0.2～0.4時，GUS瞬時表達(dá)率維持12.22%～13.33%之間，瞬時表達(dá)率指數(shù)維持在0.04和0.05之間；當(dāng)OD600nm達(dá)到0.5時，葉柄Gus瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)增加到了33.67%和0.11，達(dá)到了最大值，顯著優(yōu)于其它處理；OD600nm大于0.5時，GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)則逐漸下降。因此，適宜轉(zhuǎn)化材料的菌液光密度值OD600nm應(yīng)以0.5為最佳。

表3 菌液濃度對遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 3 Effects of different bacterial concentration on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.3 侵染時間

侵染時間是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化實驗中非常重要的影響因素[6]，侵染時間10～20 min時，GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)維持在20%和0.1左右，未顯著提高染色效果；侵染時間達(dá)到30～60 min時，GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)與10～20 min相比獲得了明顯提升，此時間范圍兩指標(biāo)沒有明顯差異，但以侵染時間60 min的兩指標(biāo)為最高，葉柄GUS瞬時表達(dá)率達(dá)到51.89%，瞬時表達(dá)率指數(shù)達(dá)到0.25，所以農(nóng)桿菌GV3101的侵染時間為30～60 min為宜，且以60 min為最佳。筆者進(jìn)行抗生素抑菌實驗中發(fā)現(xiàn)，葉片外植體經(jīng)過500 mg·L-1Cef處理后，置于100 mg·L-1Cef培養(yǎng)基中便可以抑制農(nóng)桿菌的生長，侵染60 min不會造成后期農(nóng)桿菌的過度繁殖[7]。

表4 侵染時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 4 Effects of different infection time on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.4 共培養(yǎng)pH

低于6.0的pH可以活化農(nóng)桿菌的Vir區(qū)，從而增強(qiáng)遺傳轉(zhuǎn)化效果，pH降至5.1～5.8將使Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)將達(dá)到最高水平[8]。表5顯示隨著pH的升高，葉柄GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。pH為5.2時GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)最低，5.4～6.2各個水平間GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)無顯著差異，當(dāng)pH維持在5.8～6.0時，GUS瞬時表達(dá)率和染色效果達(dá)到最高值，所以適宜GV3101轉(zhuǎn)化葉柄的共培養(yǎng)pH應(yīng)維持在5.8～6.0之間。

表5 共培養(yǎng)pH值對遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 5 Effects of different Co-culture pH on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.5 共培養(yǎng)時間

農(nóng)桿菌附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在共培養(yǎng)時期內(nèi)完成，共培養(yǎng)時間是決定轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵[8]，國內(nèi)外研究也表明共培養(yǎng)時間是影響遺傳轉(zhuǎn)化的重要參數(shù)[9-10]。多重比較分析表明（表6），共培養(yǎng)時間1 d時GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)均達(dá)到最大值，且與2、3、4、5 d存在顯著差異，而共培養(yǎng)2、3、4、5 d各處理間沒有顯著差異，所以最佳共培養(yǎng)時間為1 d。隨著共培養(yǎng)時間的延長，筆者也發(fā)現(xiàn)葉片外植體褐化率逐漸增大，所以較短的共培養(yǎng)時間既能減少農(nóng)桿菌的過度繁殖還可以提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

表6 共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 6 Effect of Co-culture time on the agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.6 乙酰丁香酮的添加試驗

乙酰丁香酮作為農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因活化的誘導(dǎo)物被廣泛應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究工作中。許多研究表明不同的乙酰丁香酮添加方式對于遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高至關(guān)重要[11-13]。

2.6.1 菌液中添加乙酰丁香酮

本研究表明，菌液中添加乙酰丁香酮并未顯著提高GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)。表7的多重比較表明雖然GUS瞬時表達(dá)率隨AS添加濃度的增大有逐漸增大的趨勢，但是各處理間的GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)的差異未達(dá)到顯著差異的水平；菌液中添加乙酰丁香酮并沒有顯著改善農(nóng)桿菌的侵染力，相反隨著GUS瞬時表達(dá)率的變大，葉柄瞬時表達(dá)率指數(shù)沒有明顯變化，卻使得葉柄的相對染色效果變差，對遺傳轉(zhuǎn)化造成了不利影響。

表7 菌液中添加乙酰丁香酮對遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 7 Effects of different AS concentration in bacterium liquid on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.6.2 共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮

與對照相比，共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮極大提高了葉柄的GUS瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)。表8顯示共培養(yǎng)基中添加50～200 mg·L-1的乙酰丁香酮與對照相比，顯著改善了葉柄GUS瞬時表達(dá)率，其中以添加100～200 mg·L-1的乙酰丁香酮使葉柄瞬時表達(dá)率指數(shù)達(dá)到最佳，添加150 mg·L-1的乙酰丁香酮時瞬時表達(dá)率指數(shù)達(dá)到最高。

表8 共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮對遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 8 Effects of different AS concentration in medium on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

3 結(jié)論與討論

本研究首次提出采用瞬時表達(dá)率指數(shù)作為評價轉(zhuǎn)化效果的一項指標(biāo)，目前，國內(nèi)外研究多采用瞬時表達(dá)率作為單一的評價指標(biāo)，但瞬時表達(dá)率存在不能確切表示出葉柄染色程度的不足，瞬時表達(dá)率指數(shù)的提出很大程度上彌補(bǔ)了單一采用瞬時轉(zhuǎn)化率的不足，使轉(zhuǎn)化評價體系更為精確合理。目前有關(guān)巨桉遺傳轉(zhuǎn)化的研究在國內(nèi)還未見報道，國際上也只有Yao J L等關(guān)于LBA4404介導(dǎo)巨桉的報道，其轉(zhuǎn)化研究僅局限于莖段再生階段抗生素敏感性和菌液濃度兩方面[14]，本研究初步建立了農(nóng)桿菌GV310介導(dǎo)巨桉Eg5葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對影響巨桉Eg5遺傳轉(zhuǎn)化的因素預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)pH值、共培養(yǎng)時間和乙酰丁香酮等一系列因素進(jìn)行了全面報道。

3.1 預(yù)培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌侵染外植體前一般要經(jīng)過一段時間的預(yù)培養(yǎng)使外植體細(xì)胞處于最佳的分裂狀態(tài)，以更好地接受外源基因的整合，許多研究也表明預(yù)培養(yǎng)對于遺傳轉(zhuǎn)化的重要性[15-21]。桉屬植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究表明預(yù)培養(yǎng)時間大多維持在2～3 d[15-18,21]，本研究也表明巨桉Eg5葉片外植體的最佳預(yù)培養(yǎng)時間為3 d，楊樹屬植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究預(yù)培養(yǎng)時間一般在0～1 d[19,22]，席夢利等確定了杉木的最佳預(yù)培養(yǎng)時間為1～3 d[20]，柚木的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化研究表明最佳的預(yù)培養(yǎng)時間為11～15 d[23]，由以上可知不同的樹種預(yù)培養(yǎng)時間存在一定的差異，可能是不同樹種在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)入最佳脫分化狀態(tài)的時間不同所致，所以預(yù)培養(yǎng)時間的確定關(guān)鍵在于使外植體細(xì)胞處于最佳的脫分化狀態(tài)，否則，則會由脫分化狀態(tài)進(jìn)入分化狀態(tài)，從而妨礙外源基因的整合，對遺傳轉(zhuǎn)化造成不利影響。

3.2 菌液光密度與侵染時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

菌液光密度和侵染時間是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的重要影響因素。本研究表明采用GV3101菌液OD600nm值0.5侵染巨桉Eg5葉片30～60 min瞬時染色效果最佳，這與桉樹屬植物多采用OD600nm值0.5以上的較濃菌液處理外植體10～30 min[14,17-18,21]的結(jié)果相一致，楊樹屬多采用OD600nm值0.2～0.4較稀菌液處理外植體10～20 min[19,22,24-25]，小麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，采用OD600nm值1.0以上菌液侵染1 h以上，方能達(dá)到較好的轉(zhuǎn)化效果[26-28]。以上表明不同植物的最佳農(nóng)桿菌菌液OD600nm值及侵染時間不盡相同，相對楊屬樹種，這說明桉屬樹種對農(nóng)桿菌不太敏感，小麥由于是單子葉植物對農(nóng)桿菌最不敏感，桉屬樹種的轉(zhuǎn)化仍需要用相對較高的菌液濃度處理一定時間才能達(dá)到較好的效果。

3.3 添加乙酰丁香酮對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

本文中研究了菌液中添加乙酰丁香酮和培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮兩種添加方式對遺傳轉(zhuǎn)化的影響。很多研究表明菌液中添加乙酰丁香酮并不能顯著改善遺傳轉(zhuǎn)化效果，甚至?xí)档瓦z傳轉(zhuǎn)化率[19，29-31]，本研究也得出了同上述研究相一致的結(jié)論，對于沒能提高轉(zhuǎn)化率，分析可能有以下原因：一是乙酰丁香酮加入菌液時間不當(dāng)，有研究認(rèn)為在工程菌液使用前4～6 h加入，也有研究主張在制備好工程菌液后加入并放置一定時間之后再用于侵染，使農(nóng)桿菌既處于對數(shù)生長期，又處于Vir基因高度活化狀態(tài)[8]。二是由于乙酰丁香酮需要加入有毒的二甲基亞砜溶解，二甲基亞砜的加入可能在一定程度上抑制了農(nóng)桿菌的侵染活力，使農(nóng)桿菌受到了毒害。三是加入的乙酰丁香酮濃度與工程菌液濃度之間存在一定協(xié)同效應(yīng)，菌液濃度過高，加入一定乙酰丁香酮則不能使遺傳轉(zhuǎn)化率提高，菌液濃度得到稀釋后，加入乙酰丁香酮則可顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化率[11]。

本研究表明共培養(yǎng)基中添加150 mg·L-1乙酰丁香酮則大大提高了遺傳轉(zhuǎn)化率，許多研究也表明了共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮對于遺傳轉(zhuǎn)化的積極作用[11,12,32]。由于共培養(yǎng)階段是轉(zhuǎn)化的最關(guān)鍵階段，共培養(yǎng)時期添加乙酰丁香酮酚類物質(zhì)促進(jìn)了農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的表達(dá)和外源基因的整合，使遺傳轉(zhuǎn)化率獲得了大大提高。但也有研究認(rèn)為乙酰丁香酮與培養(yǎng)基pH值存在協(xié)調(diào)效應(yīng)，一定pH值條件下乙酰丁香酮才可以更好發(fā)揮其高效作用[12,33]。所以乙酰丁香酮與培養(yǎng)基pH值的交互作用還有待進(jìn)一步研究。

3.4 因素優(yōu)化順序

研究采用單因素逐步優(yōu)化法建立巨桉Eg5的轉(zhuǎn)化體系，一些實驗數(shù)據(jù)存在后期優(yōu)化結(jié)果低于前期優(yōu)化結(jié)果的問題，究其原因，可以從以下方面解釋：一是提供葉片外植體的幼苗生理狀態(tài)較差，某一批次的葉片外植體生長時間過長造成后期優(yōu)化結(jié)果較低。Tournier, V等[34]和Aggarwal, D等[35]曾報道幼嫩組織的遺傳轉(zhuǎn)化率和器官發(fā)生率均較高。二是活化的不同批次的農(nóng)桿菌之間可能存在侵染活力的差異。三是不同批次的GUS染色液其染色效果可能也存在一定差異。

[1] 范春節(jié). 尾赤桉再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系研究[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院學(xué)位論文，2008.

[2] Jefferson R A, Kavanagh T A, Bevan M W. GUS fusions: betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.[J]. The EMBO journal, 1987,6(13):3901-3907.

[3] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 農(nóng)業(yè)出版社，1979.

[4] 唐克軒，張獻(xiàn)龍. 植物生物技術(shù)[M]. 科學(xué)出版社，2004.

[5] Sharma M, Kothari-Chajer A, Jagga-Chugh S, et al. Factors influencing Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of Eleusine coracana (L.) Gaertn[J]. Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 2011,105(1): 93-104.

[6] 楊 波，丁莉萍，姚 璐，等. 苗齡和農(nóng)桿菌侵染時間對小麥莖尖轉(zhuǎn)化效率的影響(英文)[J]. 分子植物育種，2008，6(2):358-362.

[7] 郭利軍，曾炳山，劉 英，等. 巨桉無性系Eg5的卡那霉素和頭孢霉素敏感性研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2012，32(3): 75-80.

[8] 王關(guān)林, 方宏筠. 植物基因工程[M]. 科學(xué)出版社，2002.

[9] Dutt M, Grosser J. Evaluation of parameters affecting Agrobacterium-mediated transformation of citrus[J]. Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 2009,98(3):331-340.

[10] 賴家業(yè)，石海明，劉 凱，等. 尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立的研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007, 44(2): 415-419.

[11] Huang F H, Li X Y. Effects of concentration of vacetosyringone and Agrobacterium tumefaciens on Gus gene transformation efficiency of Populus[J]. In Vitro Cell Dev Biol, 1994,30(3): 67.

[12] Godwin I, Todd G, Ford-Lloyd B, et al. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species[J]. Plant Cell Reports, 1991,9(12):671-675.

[13] 陳 志, 陳金慧, 李婷婷, 等. 雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)雙價抗病基因影響因子研究[J]. 分子植物育種，2007,5(4):588-592.

[14] Yao J L, Lin-Wang K. Eucalyptus transformation method[Z].WO Patent WO/2005/032,241, 2005.

[15] Ho C K, Chang S H, Tsay J Y, et al. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Eucalyptus camaldulensis and production of transgenic plants[J]. Plant Cell Reports,1998,17(9): 675-680.

[16] Prakash M, Gurumurthi K. Genetic transformation and regeneration of transgenic plants from precultured cotyledon and hypocotyl explants of Eucalyptus tereticornis Sm.using Agrobacterium tumefaciens[J]. In Vitro Cellular &Developmental Biology - Plant, 2009,45(4):429-434.

[17] Aggarwal D, Kumar A, Sudhakara Reddy M. Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of selected elite clone(s) of Eucalyptus tereticornis[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2011,33(5):1603-1611.

[18] Da Silva A L L, de Oliveira Y, Da Luz Costa J. Preliminary results for genetic transformation of shoot tip of Eucalyptus saligna Sm. via Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Biotechnology and Biodiversity, 2011,2(1):1-6.

[19] 諸葛強(qiáng), 王婕琛, 陳 英, 等. 新疆楊高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，2003,12(4):6-10.

[20] 席夢利, 施季森. 不同因素對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杉木轉(zhuǎn)化效率的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)，2007,43(3):46-50.

[21] Alcantara G B D, Bespalhok Filho J C, Quoirin M.Organogenesis and transient genetic transformation of the hybrid Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla [J]. Scientia Agricola, 2011,68:246-251.

[22] Confalonieri M, Balestrazzi A, Bisoffi S. Genetic transformation of Populus nigra by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports, 1994,13(5):256-261.

[23] 曾炳山, 裘珍飛, 李湘陽, 等. 柚木愈傷組織的LBA 4404轉(zhuǎn)化條件[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2008, 28(3): 60-64.

[24] Liu T, Pang X, Long C, et al. Successful Agrobacteriummediated transformation of Populus tomentosa with apple SPDS gene[J]. Forestry Studies in China, 2008, 10(3): 153-157.

[25] 郝貴霞, 朱 禎, 朱之悌. 毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化的研究[J]. 植物學(xué)報，1999,41(9): 936-940.

[26] Cheng M, Fry J E, Pang S, et al. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Physiology,1997,115(3):971-980.

[27] 王永勤, 張愛民. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化幾個影響因素的研究[J]. 遺傳學(xué)報，2002,29(003):260-265.

[28] 張志清, 鄭有良, 王丕武, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥幾個影響因素的再研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006, 24(1):1-6.

[29] 劉小琳, 王繼峰, 胡曉艷, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化[J]. 中國草地學(xué)報，2007, 29(2):102-106.

[30] 鄭樹松, 安成才, 李啟任, 等. 乙酰丁香酮對棉花下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響[J]. 棉花學(xué)報，2003,15(2):125-126.

[31] 楊秀榮, 陳永文, 方 平, 等. 乙酰丁香酮對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的影響[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002,27(5):751-754.

[32] 董喜才, 杜建中, 王安樂, 等. 乙酰丁香酮在植物轉(zhuǎn)基因研究中的作用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011, 32(5): 292-299.

[33] Holford P, Hernandez N, Newbury H J. Factors influencing the efficiency of T-DNA transfer during co-cultivation of Antirrhinum majus with Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports, 1992,11(4): 196-199.

[34] Tournier V, Grat S, Marque C, et al. An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree(Eucalyptus grandis× Eucalyptus urophylla)[J]. Transgenic Research, 2003,12(4): 403-411.

[35] Aggarwal D, Kumar A, Reddy M S. Shoot organogenesis in elite clones of Eucalyptus tereticornis[J]. Plant cell, tissue and organ culture, 2010,102(1): 45-52.

Study on the factors influencing Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Eucalyptus grandis clone Eg5

GUO Li-jun, ZENG Bing-shan, LIU Ying, LI Xiang-yang, QIU Zhen-fei
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

∶ By taking Eucalyptus grandis clone Eg5 leaves as explants, the GUS gene transient expression efficiency and transient expression efficiency index as evaluation indicators, effects of the pre-culture time, bacterial concentration, infection time, co-culture pH, co-culture time,Acetosyringone（AS）concentration in the bacterium liquid and Acetosyringone concentration in the medium on genetic transformation were investigated. The results show that pre-culture 3 days, 0.5 of OD600nm, 30～60 min of infection time, 5.8～6.0 of co-culture pH, 150 mg·L-1AS of the medium, and no AS in the bacterium liquid, 1day of co-culture time, the best transformation effects were achieved. Thus, an effective system for Agrobacterium-mediated transformation of Eucalyptus grandis clone Eg5 was established.

∶ Eucalyptus grandis; Agrobacterium tumefaciens; Eg5; genetic transformation

S792.39；Q943.2

A

1673-923X(2012)06-0061-06

2012-03-09

863高新技術(shù)項目“白樺、桉樹等分子育種與品種創(chuàng)制”項目編號(2011AA100202)

郭利軍(1983—)，男，河北蠡縣人，碩士研究生，主要從事熱帶林木組培快繁和桉樹轉(zhuǎn)基因研究

曾炳山(1969—)，男，江西井岡山人，博士，研究員，主要從事熱帶林木組培快繁和基因轉(zhuǎn)化研究

[本文編校：吳 彬]