邊 慧, 范耀東, 郭立云, 余化霖

(1. 昆明醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)神經(jīng)外科, 云南 昆明 650032; 2. 昆明醫(yī)學院 生理教研室 云南 昆明 650031; 3. 昆明醫(yī)學院 第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科, 云南 昆明 650106; 4. 昆明醫(yī)學院 第四附屬醫(yī)院眼科, 云南 昆明 650021)

在大鼠玻璃體內(nèi)移植獼猴神經(jīng)前體細胞的方法探索

邊 慧1,2,#, 范耀東1,3,#, 郭立云4, 余化霖1,*

(1.昆明醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)神經(jīng)外科,云南 昆明650032; 2.昆明醫(yī)學院 生理教研室 云南 昆明650031; 3.昆明醫(yī)學院 第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,云南 昆明650106; 4.昆明醫(yī)學院 第四附屬醫(yī)院眼科,云南 昆明650021)

探索一種簡單、可行的異種神經(jīng)前體細胞眼內(nèi)移植方法。采用機械性損傷方法造成大鼠視網(wǎng)膜局部受損, 然后在損傷眼及對照眼玻璃體內(nèi)移植綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)標記的獼猴神經(jīng)前體細胞,觀察細胞能否存活。結(jié)果顯示：經(jīng)激光共聚焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)移植細胞在損傷眼及對照眼內(nèi)均可存活并整合至損傷眼視網(wǎng)膜。實驗表明, 玻璃體內(nèi)異種移植GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞可以存活并整合, 是一種可行的移植方法。

獼猴; 神經(jīng)前體細胞; 玻璃體; 移植

玻璃體是一種高度水化的細胞外基質(zhì)成分, 呈無色透明凝膠狀態(tài)，主要由水(＞95%)、膠原纖維、透明質(zhì)酸和可溶性蛋白組成。 此外，還含有白蛋白、硫酸軟骨素、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸及無機離子等成分，pH值接近中性，構(gòu)成眼內(nèi)最大容積(Bishop, 2000; Kleinber et al, 2011 )。玻璃體的膠凍狀結(jié)構(gòu)是一種理想的培養(yǎng)基, 可以給細胞提供一個良好的眼內(nèi)代謝微環(huán)境, 為移植細胞的長期存活及廣泛遷移提供營養(yǎng)支持(Coles et al, 2004)。以往的研究顯示, 將成年大鼠海馬來源的神經(jīng)前體細胞移植至成年大鼠玻璃體腔內(nèi), 移植細胞至少可以存活8周(Takahashi et al, 1998); 增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)標記的轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓來源的神經(jīng)前體細胞細胞移植到成年小鼠玻璃體內(nèi)可以存活6個月(Pressmar et al, 2001)。

視網(wǎng)膜由胚胎時期神經(jīng)外胚層形成的視杯發(fā)育而來, 是高度特化的神經(jīng)組織。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外延部分, 視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)相對簡單, 細胞呈清晰而明顯的分層狀排列(Klassen et al, 2004)。視網(wǎng)膜在神經(jīng)干細胞移植研究中具有獨特的部位優(yōu)勢。由于眼底可以直視, 當以GFP標記的細胞作為移植供體時, 應(yīng)用眼底熒光照相或長波紫外線可以對GFP發(fā)出的熒光直接進行活體重復觀察, 即可通過非侵入性的方法獲取和追蹤移植細胞的存活、遷移及與宿主的聯(lián)系等情況(Bennett et al, 1997)。此部位實驗操作、取材方便, 不需要進入腦內(nèi)觀察供、受體神經(jīng)細胞之間的聯(lián)系及整合, 且充分體現(xiàn)出外延的優(yōu)勢, 因此，在干細胞移植研究中得到廣泛的應(yīng)用。

獼猴在進化上是與人類非常相近的動物, 其生理學、解剖學、遺傳學、系統(tǒng)發(fā)育學等方面與人類非常相似(Calhoun et al, 2003; Kuai et al, 2009), 有關(guān)非人靈長類神經(jīng)前體細胞的研究不僅可以加深對干細胞生物學的基礎(chǔ)理論理解, 而且對實現(xiàn)干細胞替代治療具有重要意義。Li et al（2005）前期的研究工作表明，將獼猴胚胎干細胞誘導分化而來的神經(jīng)前體細胞異種移植到成年大鼠腦內(nèi), 移植細胞能夠在受體腦內(nèi)存活并且分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。獼猴神經(jīng)前體細胞作為替代治療的上選細胞株能否異種移植至嚙齒類動物玻璃體, 目前尚未見相關(guān)報道。近年來的研究表明, 受損傷的視網(wǎng)膜可以易化眼內(nèi)移植局部微環(huán)境, 有利于移植細胞的存活及整合(Bull et al, 2008; Young et al, 2000)。為此,本研究采用機械性損傷方法建立大鼠視網(wǎng)膜局部損傷模型, 損傷后將GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞異種移植入玻璃體, 觀察細胞在玻璃體內(nèi)能否存活,從而探索一種可行的移植方式, 為細胞替代治療視網(wǎng)膜疾病提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠, 體重180～200 g, 購于昆明醫(yī)學院實驗動物中心, 許可證編號SCXK(滇)2011-0004。所有實驗用鼠自購買后, 在本實驗室至少適應(yīng)一周。大鼠飼養(yǎng)在動物籠內(nèi), 自由進水、取食, 12小時明：暗交替, 室溫(23 ±2) ℃, 操作符合動物實驗管理條例。大鼠分為2組：損傷組(右眼)(n=25); 對照組(左眼)(n=25)。

1.2 模型建立及細胞移植

硫酸阿托品注射液(天津金耀氨基酸有限公司) 0.3 mL/只，10%水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)400 mg/kg體重腹腔注射致動物麻醉后, 將大鼠固定在腦立體定位儀上(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。碘伏消毒結(jié)膜囊及瞼裂周圍皮膚，結(jié)膜囊內(nèi)滴貝諾喜眼液(Alcon Laboratories, Inc) 1滴行表面麻醉，復方托吡卡胺滴眼液(Alcon Laboratories, Inc) 1滴散大瞳孔。GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞由中科院昆明動物所王正波博士惠贈 (GFP標記的獼猴胚胎干細胞團塊懸浮培養(yǎng), 形成的胚體貼壁培養(yǎng),誘導分化形成具有玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)的神經(jīng)前體細胞,備用)。用5 μL的微量進樣器吸取3 μL (約含細胞1 ×105個/μL)GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞懸液備用。眼科鑷提起球結(jié)膜, 暴露大鼠角鞏膜緣, 在其后約4 mm處12:00位置進針。注意保持與地面垂直的角度, 繼續(xù)進針到玻璃體內(nèi), 將對側(cè)6:00處視網(wǎng)膜劃傷, 造成視網(wǎng)膜機械性損傷, 具體實驗?zāi)Ｐ椭谱鞣椒▍⒄瘴墨I(Nisbida et al, 2000)進行。稍退針至玻璃體內(nèi)注射獼猴神經(jīng)前體細胞懸液3 μL。手術(shù)結(jié)束時，結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼藥膏預(yù)防感染。術(shù)后繼續(xù)采用預(yù)防感染措施3 d, 白天滴氯霉素眼藥水,晚上涂紅霉素眼藥膏。

1.3 移植后處理

移植細胞后7周, 將大鼠深度麻醉后，經(jīng)左心室插管分別使用0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛溶液灌注固定，仔細分離出鼠左右眼球后，將其固定于4%多聚甲醛溶液, 置于4 ℃冰箱過夜保存。經(jīng)20%、30% PBS蔗糖溶液梯度脫水后，使用冰凍切片機(LEICA CMI850)切片, 片厚20 μm。激光共聚焦顯微鏡 (ZEISS LSM 510 META)觀察移植細胞存活及分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 動物眼球觀察

獼猴神經(jīng)前體細胞移植后，觀察大鼠雙側(cè)眼球,可見角膜透明, 玻璃體腔內(nèi)可見點狀、條索狀或網(wǎng)狀灰白色混濁物, 各組均未見眼內(nèi)感染。

2.2 組織學檢查

切片經(jīng)HE染色顯示, 右眼視網(wǎng)膜由于機械性損傷造成視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂, 結(jié)構(gòu)層次被破壞, 神經(jīng)上皮層扭曲, 斷裂, 部分細胞萎縮消失。 損傷灶周圍可見成簇紅細胞(圖1)。

圖1 機械性損傷大鼠右眼局部視網(wǎng)膜Fig.1 Mechanical injury in the right retina of rat

2.3 細胞移植后觀察

冰凍切片后, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對照眼(左眼)玻璃體內(nèi)有大量移植GFP陽性細胞存活(圖2)，損傷眼(右眼)局部視網(wǎng)膜上出現(xiàn)GFP陽性細胞整合(圖3)。

3 討 論

判斷局部微環(huán)境是否適合移植細胞生存以及移植方法是否切實可行是移植工作的重要組成部分。在移植工作中要盡量做到對宿主組織、供體細胞或組織自身損傷小, 從而確保移植細胞的有效存活, 因此，選擇更適合、更可靠、更行之有效的異種神經(jīng)前體細胞移植方法仍需探索(Lund et al, 2001)。本研究采用機械性損傷方法造成大鼠右眼視網(wǎng)膜局部損傷后, 在玻璃體內(nèi)移植細胞觀察存活情況。與此同時, 以正常左眼作為對照亦系移植細胞,觀察神經(jīng)前體細胞在兩者中的存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論在損傷眼還是對照眼內(nèi)獼猴神經(jīng)前體細胞均可存活。該結(jié)果與Grozdanic et al (2006)研究相似。

圖2 GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞移植至大鼠對照眼玻璃體內(nèi)Fig.2 GFP positive rhesus monkey neural progenitor cells xenotransplant in the left eye of rat

圖3 GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞整合至大鼠損傷眼視網(wǎng)膜Fig.3 GFP positive rhesus monkey neural progenitor cells integrated in the injured retina of the rat

目前常用的眼內(nèi)移植干細胞的方法有經(jīng)玻璃體和經(jīng)鞏膜2種途徑。經(jīng)鞏膜通路(視網(wǎng)膜下移植)對技術(shù)及設(shè)備要求相對更高且操作復雜, 手術(shù)時，術(shù)野暴露有限, 會破壞脈絡(luò)膜血管和Bruch’s膜, 導致視網(wǎng)膜內(nèi)外層之間分離以及血眼屏障破壞、受體早期致敏等并發(fā)癥(Al-Amro et al, 1999; Lund et al, 2001)。經(jīng)玻璃體通路術(shù)野清晰，容易操作, 可控制性更好, 損傷相對小, 并不破壞視網(wǎng)膜的屏障解剖結(jié)構(gòu), 而且玻璃體可以為移植細胞長期存活和廣泛遷移提供營養(yǎng)支持, 故經(jīng)玻璃體通路更具優(yōu)勢(Baker & Brown, 2009; Coles et al, 2004; Meyer et al, 2004)。本研究采用經(jīng)玻璃體通路法進行移植, 手術(shù)過程中通過散大的瞳孔可以清晰看到微量注射器針頭的走向及注射部位。這種近似直視下的操作對移植靶組織造成的損傷相對更小，且感染發(fā)生率低(本實驗無一只眼球術(shù)后出現(xiàn)感染)。移植后方便觀察, 可同時進行雙側(cè)對比, 透過瞳孔可見白色點狀物和絮狀物在玻璃體內(nèi)生長。本研究采用機械性損傷方法造成大鼠視網(wǎng)膜受損后, 在損傷眼及正常眼內(nèi)經(jīng)玻璃體通路異種移植GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞, 觀察細胞存活情況。結(jié)果顯示GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞在玻璃體腔內(nèi)至少能存活7周, 表明經(jīng)玻璃體異種移植獼猴神經(jīng)前體細胞是一種可行的移植方式。本研究為探索更佳的動物模型建立方法及可行的細胞移植方法奠定了基礎(chǔ), 為進一步探索視網(wǎng)膜疾病的干細胞移植研究和治療提供了技術(shù)支持。

另外, 前人的工作提示, 成年大鼠海馬源性神經(jīng)前體細胞移植至成年大鼠玻璃體后可形成一個緊鄰視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的連續(xù)的細胞薄層, 該薄層主要生長在靠近內(nèi)界膜處, 其間有少量移植細胞可整合到宿主視網(wǎng)膜, 但并不破壞宿主的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(Takahashi et al, 1998)，將胚胎小鼠脊髓源性神經(jīng)前體細胞移植到成年野生型小鼠及視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良突變型小鼠玻璃體內(nèi), 無論是正常成年小鼠的視網(wǎng)膜還是營養(yǎng)不良的視網(wǎng)膜內(nèi), 異位移植的細胞均可存活、分化及整合。移植細胞胞體多位于視網(wǎng)膜的內(nèi)網(wǎng)狀層, 細胞突起可伸入神經(jīng)纖維層(Pressmar et al, 2001)。目前本實驗的工作只是初步證明了GFP標記的獼猴神經(jīng)前體細胞能夠在大鼠玻璃體內(nèi)存活, 并發(fā)現(xiàn)少量移植細胞可整合至宿主視網(wǎng)膜。移植細胞能否在形態(tài)上向視網(wǎng)膜樣細胞分化，以及是否具有視網(wǎng)膜細胞功能還需進一步進行研究。

致謝：感謝中科院昆明動物所馬原野研究員、胡新天研究員給予的幫助, 感謝王正波博士給予的幫助。

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A technique of rhesus monkey neural progenitor cells intravitreal transplant to rats

BIAN Hui1,2,#, FAN Yao-Dong1,3,#, GUO Li-Yun4, YU Hua-Lin1,*

(1. Department of Minimally Invasive Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032,China; 2. Department of Physiology, Kunming Medical College, Kunming Yunnan 650031, China; 3. Department of Neurosurgery, Third Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming Yunnan 650106,China; 4. Department of Ophthalmology, Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650021,China)

To investigate a simple and effective intraocular xenotransplant technique of rhesus monkey neural progenitor cells to rats, mechanical injury was induced in the rat’s right retina. And the GFP-labeled rhesus monkey neural progenitor cells suspension was slowly injected into the vitreous space of the right injured and left control eye. Confocal image suggested that the xenografted cells survived in both the injured and control eye, meanwhile the cells integrated in the injured right retina. The results demonstrated that intravitreal xenotransplant could be adopted as a simple and reliable method.

Rhesus monkey; Neural progenitor cells; Vitreous; Transplant

Q959.848; R779.65; Q813.3

A

0254-5853-(2012)01-0085-04

10.3724/SP.J.1141.2012.01085

2011-10-27；接受日期：2011-12-30

“973”計劃(2007CB947703)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: yuhl308@126.com

#并列第一作者(Authors contributed equally to the work)

邊 慧,昆明醫(yī)學院在讀博士研究生, E-mail: bh_032001@yahoo.com.cn