謝 強(qiáng)，何余勇，羅定棋，趙磊峰，張永輝，年夫照，謝云波

(1.四川省煙草公司瀘州市公司 技術(shù)中心，四川 瀘州 646000;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650203)

煙草常采用有性繁殖，但易發(fā)生變異，造成品質(zhì)退化及多種病害發(fā)生，影響經(jīng)濟(jì)收入。組織培養(yǎng)可以保持煙草品種的優(yōu)良性狀，減少病蟲害，從而達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目的［1］。近年來，在烤煙及烤煙變異株的繁育上，組培技術(shù)發(fā)揮了積極作用。謝慶華等［2］從五種培養(yǎng)基中篩選出最佳配方，探索利用烤煙組織培養(yǎng)來提供市場所需的大量種苗;彭劍濤等［3］利用組織培養(yǎng)技術(shù)，篩選獲得煙草抗性材料;謝麗瓊等［4］則對植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基有機(jī)組分進(jìn)行了失效分析。

雖然植物組織培養(yǎng)的操作過程并不復(fù)雜，但一些技術(shù)環(huán)節(jié)要求卻十分嚴(yán)格，若出現(xiàn)一些技術(shù)細(xì)節(jié)失誤，就會使試驗無法進(jìn)行下去，甚至導(dǎo)致整個試驗的失敗［5-6］。目前，關(guān)于煙草組織培養(yǎng)的報道已非常多，主要集中在組培外植體選擇及植物激素配比等方面。本文根據(jù)烤煙組培過程中出現(xiàn)的問題，結(jié)合文獻(xiàn)，對烤煙組培過程中常見問題與引發(fā)原因進(jìn)行了分析，旨在為烤煙組培快繁提供一些參考依據(jù)。

1 烤煙組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是依據(jù)植物細(xì)胞全能性及植物的再生作用，通過無菌操作分離植物體的一部分，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程［7-8］。隨著研究領(lǐng)域的不斷拓展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)從最初的無性繁殖逐步滲透到植物生理學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)以及生物化學(xué)等各個領(lǐng)域，成為生物學(xué)科中重要研究技術(shù)和手段［9］。在植物脫毒及快速繁殖、單倍體育種、突變育種、體細(xì)胞雜交育種、工廠化育苗、藥用植物開發(fā)與種子資源保存等方面具有重要的應(yīng)用前景。

烤煙是我國煙草生產(chǎn)的重要組成部分，對于改善煙區(qū)經(jīng)濟(jì)和農(nóng)村基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)發(fā)揮著重要的作用。同時，煙草還是典型的基因工程模式植物［10］，在科學(xué)研究方面發(fā)揮著重要作用。近年來，人們在煙草的組織培養(yǎng)中已取得了很大的突破，相關(guān)報道層出不窮［2，11-12］，這為煙草的快速繁殖，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用與推廣等提供了有利的基礎(chǔ)條件。

2 烤煙組織培養(yǎng)污染與控制

2.1 烤煙組織培養(yǎng)污染的原因

烤煙組織培養(yǎng)污染源包括內(nèi)因污染和外因污染。內(nèi)因污染指由于外植體的表面消毒或者內(nèi)部帶菌而引起的污染;外因污染則是由環(huán)境污染和操作不當(dāng)引起，主要是在接種或培養(yǎng)過程中病菌入侵［8］。相比而言，內(nèi)因污染比外因污染更難控制，特別是外植體內(nèi)部帶菌，表面消毒劑的作用效果不明顯。

造成污染的病原主要為細(xì)菌、真菌和內(nèi)源菌［6］，從微生物種類上可分為真菌污染和細(xì)菌污染，并常表現(xiàn)為復(fù)合污染。真菌污染表現(xiàn)為霉菌污染，是由于超凈工作臺等操作環(huán)境不清潔及操作不當(dāng)?shù)纫?細(xì)菌污染則表現(xiàn)為白色、透明色或有色的膿狀物，常由于外植體帶菌、滅菌不徹底或操作不慎造成;內(nèi)源菌污染則可能表現(xiàn)出前兩者的癥狀，常由于外植體材料內(nèi)部的微生物 (真菌、細(xì)菌)不能被一般的表面消毒方法清除而引起 (圖1)。

2.2 烤煙組織培養(yǎng)污染控制的措施

圖1 烤煙組織培養(yǎng)過程中常見的污染現(xiàn)象

烤煙組織培養(yǎng)中污染產(chǎn)生的原因，應(yīng)從外植體消毒和無菌操作兩方面來改善?？刂仆庵搀w自身帶菌，可通過一系列消毒處理來減少或控制;至于內(nèi)源菌污染的外植體，可通過外植體的預(yù)培養(yǎng)來控制;通過無菌操作來提供對無菌的環(huán)境條件。

2.2.1 外植體的消毒

盡量選用無菌的外植體材料，以減少外植體自身帶菌的影響。利用一些消毒劑，如5%～10%的漂白粉、75%酒精、0.1%升汞、2%～10%次氯酸鈉和10%過氧化氫等殺死外植體表面的各種微生物。根據(jù)不同材料選用不同的消毒劑及其適宜的濃度和處理時間，運用不同的消毒方法［13］。本研究采用10%過氧化氫作為消毒劑，8 min消毒時間能夠取得很好的消毒效果;同時，在外植體消毒的最后環(huán)節(jié)，將消毒過的外植體在抗生素溶液中浸泡2～3 min，對于減少組培過程中的污染也具有良好的效果。

2.2.2 無菌操作與培養(yǎng)

操作人員要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，減少或避免培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基的污染。操作人員在進(jìn)入接種室前，要換上消過毒的工作服、鞋帽和口罩［13］，并戴上無菌乳膠手套;操作前，超凈工作臺要用紫外燈殺菌8～10 min，操作人員要用75%酒精擦洗雙手，操作中也要間歇性擦洗;每次操作結(jié)束之后，剪刀、鑷子、手術(shù)刀等工具都要灼燒滅菌。

經(jīng)過消毒后的外植體接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，要注意培養(yǎng)箱的無菌控制，打開培養(yǎng)箱要輕開輕閉，避免大的空氣流通;另外，在培養(yǎng)基中加入適宜濃度的抗生素，如青霉素、鏈霉素、土霉素、頭孢霉素等細(xì)菌、真菌抗生素，也能夠較好地抑制雜菌的污染。

3 烤煙組織培養(yǎng)玻璃化與控制

3.1 玻璃化發(fā)生的原因

植物組織培養(yǎng)中，常可以見到一些半透明狀的畸形試管苗，這類植物體被稱為玻璃苗，這種現(xiàn)象被稱為玻璃化現(xiàn)象［14］(圖2)。

圖2 烤煙組織培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象

發(fā)生玻璃化的組培苗，其組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常，分化能力低下，玻璃化已成為組織培養(yǎng)工作中的一大難題。導(dǎo)致玻璃化的因素很多，不同植物玻璃化誘發(fā)因素往往不同，引起烤煙組織培養(yǎng)的玻璃化現(xiàn)象的原因可能有:在培養(yǎng)過程中的光照、溫度、濕度和pH值等條件與適生環(huán)境差別較大;烤煙外植體部位、類型、素質(zhì)等誘導(dǎo)玻璃苗的發(fā)生;培養(yǎng)基的成分如Ca，N，Mn，F(xiàn)e，B，Zn含量低等。

3.2 減輕玻璃化的控制措施

減少烤煙組織培養(yǎng)過程中的玻璃化現(xiàn)象，可以通過合理選擇外植體類型，優(yōu)化、調(diào)控培養(yǎng)基配方，為不同階段的培養(yǎng)物提供適宜的生長環(huán)境。一是合理選擇烤煙組培外植體的類型?？緹熃M培常用的外植體有莖段、莖尖、幼嫩葉片和根尖等，一般幼嫩葉片和莖尖組織可以減少玻璃化。二是適當(dāng)利用固體培養(yǎng)基，增加培養(yǎng)基硬度。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，提高瓊脂濃度，玻璃化的比例明顯下降［15］。三是適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素的濃度，根據(jù)組培的不同階段，合理調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素與生長素的比例。四是適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基中的滲透勢，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分。五是盡可能降低培養(yǎng)容器內(nèi)的相對空氣濕度和改善氧氣供應(yīng)狀況，要注意薄膜的通透性或改用透氣膜。

4 烤煙組織培養(yǎng)黃化與控制

黃化是指在組培過程中由于培養(yǎng)基成分、環(huán)境、激素、碳水化合物等各種因素引起的幼苗整株失綠，全部或部分葉片黃化、斑駁 (圖3)。

引起烤煙組織培養(yǎng)過程中黃化的原因主要有:培養(yǎng)基中Fe的含量不足;各種礦質(zhì)營養(yǎng)不均衡;培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶內(nèi)乙烯含量升高;激素配比不當(dāng);糖用量不足或長時間不轉(zhuǎn)移致使糖已耗盡;pH值變化過大;培養(yǎng)溫度不適;光照不足等［15］。

圖3 烤煙組織培養(yǎng)過程中黃化現(xiàn)象

減少烤煙組織培養(yǎng)過程中黃化的關(guān)鍵，在于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中成分與含量，改善組培環(huán)境，主要有:在配制母液和培養(yǎng)基的制作過程中，對培養(yǎng)基的每一個化學(xué)成分都要認(rèn)真細(xì)致地核對，稱量的每一個環(huán)節(jié)務(wù)求精確;減少培養(yǎng)基消耗，及時轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物，避免因培養(yǎng)基營養(yǎng)不足導(dǎo)致組培苗黃化;選用通氣良好組培瓶或罐，使用透氣的封口膜，改善瓶內(nèi)通氣狀況;適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值、激素配比和無機(jī)鹽濃度，減少抗生素的用量和頻率;改善培養(yǎng)室內(nèi)的溫濕度環(huán)境，適當(dāng)增加光照。

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