溫鵬飛，王 蓓，張建成，牛鐵泉，倉國營，邢延富

（山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801）

組織培養(yǎng)又稱離體培養(yǎng)，狹義地講，是指用植物各部分組織（如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等）進行培養(yǎng)獲得再生植株[1]。組織培養(yǎng)不僅可以快速繁殖優(yōu)良種苗，而且還可以培育脫毒苗木，保持其優(yōu)良性狀[2-3]。此外，組織培養(yǎng)也為育種提供了許多手段和方法，使育種工作能更有效地進行[4-6]。在組織培養(yǎng)中，外植體滅菌是最關鍵的一步。大田的園藝作物常常帶有各種各樣的病菌，因而，在接種前一定要對其進行徹底滅菌才可以保證后續(xù)試驗的成功。一般生產(chǎn)實踐上，多用自來水反復沖洗，之后用不同的滅菌劑進行殺菌，如酒精、次氯酸鈉和升汞等[7-9]。藥劑的濃度和滅菌時間決定了外植體的感染、褐化和愈傷組織的分化。藥劑濃度過大，滅菌時間過長，超過了細胞的忍耐力，細胞就會褐變死亡；但時間和濃度如果過短過輕，則可能無法殺死外植體表面的細菌[10-11]。因而，尋求最佳的藥劑及其濃度和時間組合，控制外植體褐變率，是組培成功的關鍵。

葡萄葉片富含多酚類物質，為避免其褐變率過高，往往需要進行一些藥劑處理，如抗壞血酸和PVP 等[12]。在完整植物體的細胞中，酚類化合物和多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。當外植體切割后，切口附近細胞的分隔效應被打破，酚類化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌類化合物，醌類化合物又會在酪氨酸酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活，導致組織代謝紊亂，生長受阻，最終逐漸死亡[13-14]。研究表明，酶促褐變是由多酚氧化酶引起的。次氯酸鈉（sodium hypochlorite）是一種強氧化劑和消毒劑，能夠使多酚氧化酶在一定程度上失活，且具有較強的消毒能力，因而，常被作為易氧化褐變的外植體的滅菌劑[15-16]。

本研究以美樂葡萄的葉片為外植體，對次氯酸鈉濃度和滅菌時間進行梯度設置，在MS 培養(yǎng)基上接種且觀察，尋找褐變率最低的組合，以期為葡萄組織培養(yǎng)提供技術支持，并為后續(xù)的試驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

美樂葡萄（Vitis vinifera L. Merlot）葉片采自山西農(nóng)業(yè)大學園藝站。選取面積為5 cm2左右幼嫩葉片[14]進行處理。

1.2 試驗方法

全部采用MS 培養(yǎng)基[17]，并添加激素4 mol/L 2，4-D 和2 mol/L 6-BA 以及3%蔗糖和7.5 g/L瓊脂，pH 值為5.8。

把采好的樣品進行預處理，即先用自來水反復沖洗約5 min，洗干凈表面的泥土污漬后，再用75%酒精浸泡30 s，之后用滅菌后的蒸餾水沖洗葉片上的酒精，最后用次氯酸鈉進行滅菌。次氯酸鈉滅菌時間分別為30（A1），60（A2），90（A3）s，濃度（w/V）分別為1%（B1），2%（B2）和3%（B3）。

把處理好的葉片接種在培養(yǎng)基上，貼好標簽，放入培養(yǎng)室進行培養(yǎng)（光培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h），5 d 后觀察感染褐變和愈傷情況。

2 結果與分析

2.1 接種后感染及愈傷組織發(fā)生情況

從圖1 和表1 可以看出，通過自來水沖洗后用酒精進行浸泡，不同濃度次氯酸鈉滅菌均能達到滿意的效果，各處理接種后均無污染現(xiàn)象發(fā)生。此外，次氯酸鈉各處理組中均有愈傷組織產(chǎn)生。這表明，次氯酸鈉滅菌效果能夠滿足后續(xù)試驗要求。

表1 葉片接種后污染及愈傷情況

2.2 次氯酸鈉濃度對褐變率的影響

不同濃度次氯酸鈉對葡萄葉片組培褐變率的影響如圖2 所示。由圖2 可知，不同濃度次氯酸鈉滅菌后褐變率因滅菌時間不同而存在明顯差異，且當滅菌時間不同時，不同濃度次氯酸鈉表現(xiàn)出不同的褐變率。當處理時間較短（30 s）時，高濃度次氯酸鈉褐變率較低；而當處理時間延長后，較高濃度（2%）則表現(xiàn)較好。這表明，次氯酸鈉的滅菌效果與滅菌時間關系密切。方差分析結果表明，1%，3%，2%處理兩兩之間差異達顯著水平。

2.3 次氯酸鈉滅菌時間對褐變率的影響

次氯酸鈉滅菌時間對褐變率的影響如圖3所示。

由圖3 可知，當次氯酸鈉濃度較低（1%）時，其褐變率隨處理時間延長而降低。這表明，低濃度次氯酸鈉處理在短時間（30 s）內(nèi)難以達到最佳的滅菌效果。而當處理時間延長（60 s）后，褐變率因濃度不同而表現(xiàn)不同。當處理時間為60 s 時，2%次氯酸鈉處理褐變率最低；而當處理時間為90 s 時，3%濃度的褐變率最低。這表明，次氯酸鈉處理時間的延長和使用濃度具有互補性，也就是說，短時間處理應采用高濃度，而長時間處理則應使用低濃度。方差分析結果表明，90，60 s 處理與30 s 處理之間差異達顯著水平，90 s 處理與30 s 處理之間差異達極顯著水平。

2.4 次氯酸鈉濃度和處理時間互作對褐變率的影響

當同時考慮次氯酸鈉濃度和處理時間時，二者表現(xiàn)出明顯的互作效應（表2）。二因素互作的情況下，褐變率較小的組合為A1B2 和A2B2，且均在0.01 水平上與其他組合差異顯著，但二者之間差異不顯著。因此，這2 個組合為次氯酸鈉對美樂葡萄葉片組培的最優(yōu)滅菌方案，即用2%的次氯酸鈉滅菌外植體葉片30～60 s。

表2 滅菌時間和藥劑濃度互作對褐變率影響的多重比較

3 討論

次氯酸鈉（sodium hypochlorite）是一種強氧化劑、漂白劑和消毒劑，其強氧化性可以使多酚氧化酶在一定程度上失活，且具有較強的消毒能力[15-16]。本試驗結果表明，次氯酸鈉對葡萄葉片組培中褐變率存在明顯的抑制作用，且其最佳處理方法為用2%的次氯酸鈉處理30～60 s。

前人研究結果表明，褐變的主要原因是由于多酚氧化酶的存在，且多酚氧化酶的活性與多酚濃度有關[18-24]。多酚濃度較低時，隨濃度的增加多酚氧化酶活力也增強；而當濃度繼續(xù)增加時，氧化反應速度上升緩慢，且后期有下降趨勢[25]。Yu等[18]對葡萄進行研究發(fā)現(xiàn)，從側生枝切取的莖尖比延長蔓更容易成活，進一步研究還發(fā)現(xiàn)，蔓的酚類物質比莖尖高。有研究表明，卡特蘭在新莖旺盛生長季節(jié)（6—9 月）的褐變率顯著增加，在生長較弱的冬春季則顯著減少，相反，紅豆杉在旺盛的生長季節(jié)的幼嫩莖段褐變少，愈傷組織的發(fā)生率高，這種季節(jié)性差異的主要因素也是由于植物體內(nèi)酚類物質含量多少造成的[19-20]。

此外，正常組織（如葡萄葉片）雖然含有豐富的多酚類物質但并不發(fā)生褐變，則是由于細胞內(nèi)酚類物質和PPO 的區(qū)域性所致[21]，細胞室結構的破壞，使底物和酶結合，這是褐變不可或缺的因素[22]。鞠志國等[23]研究發(fā)現(xiàn)，液泡是貯存酚類物質的場所且不含PPO，PPO 則主要分布在細胞質中。謝春艷等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，有活性的PPO 定位于正常細胞的質體中，其他類型的PPO 則存在于各種囊泡中。這表明，正常情況下，細胞內(nèi)PPO和多酚類物質的分布存在嚴格的細胞區(qū)隔。劉曼西[27]的研究同樣也證實，截斷酚類物質與多酚氧化酶的接觸可以有效地防止褐變。

本試驗結果表明，次氯酸鈉低濃度（1%）時，其褐變率均較高，這可能是由于濃度較低，難以抑制多酚氧化酶活性而導致褐變發(fā)生嚴重。當濃度為2%時，次氯酸鈉的濃度可以與多酚氧化酶發(fā)生反應，阻擋了多酚氧化酶與酚類物質的反應，因而，其褐變率下降；當次氯酸鈉的濃度繼續(xù)升高到3%時，不但阻擋了多酚氧化酶與酚類物質的反應，同時由于濃度較高，對植物細胞也造成了嚴重的影響，導致細胞死亡，因而，其褐變率再次升高。

此外，本試驗結果表明，當滅菌時間為30 s時，1%，2%和3%的褐變率依次為84%，52%和62%；當滅菌時間為60 s 時，其褐變率依次為73%，51%和82%，均表現(xiàn)為褐變率隨處理時間延長而有所降低。這可能是由于處理時間較短時，次氯酸鈉與葡萄葉片里的多酚氧化酶產(chǎn)生反應，低濃度的次氯酸鈉（1%）由于沒有足夠的底物濃度，而無法中和掉葉片中使酚類反應褐變的多酚氧化酶，所以，酚類物質會在和多酚氧化酶的接觸中褐化，因而，褐化率較高；當滅菌時間達到90 s 時，3 種濃度的次氯酸鈉幾乎對褐變率影響不大，均在70%左右。這可能是由于處理時間較長（90 s），次氯酸鈉與植物細胞接觸時間過長，其含量已不是褐變的決定因素，因此，無論次氯酸鈉濃度為多少，其褐變率均變化不大。

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