孫芬變，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

尖孢鐮刀菌侵染引起的植物枯萎病是一種世界性的土傳真菌病害，病菌及其產(chǎn)生的膠狀物能夠通過侵染植物的導(dǎo)管[1]，從而使植物缺水萎蔫；也可以通過與植物相互作用產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶類從而破壞植物。萬壽菊殺菌素是由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院相關(guān)課題組研制合成的，是在經(jīng)過對萬壽菊根粗提物中抑菌活性成分分離與分析鑒定以后，人工模擬合成的一類精油類殺菌制劑[2]。該藥劑對尖孢鐮刀菌的殺滅效果良好[3-4]。但是，關(guān)于殺菌劑對尖孢鐮刀菌侵染活性的作用機(jī)理目前報(bào)道尚少。

本試驗(yàn)應(yīng)用生理生化的方法研究了萬壽菊殺菌素水乳劑對尖孢鐮刀菌侵染活性的影響，初步探索萬壽菊殺菌素防治尖孢鐮刀菌侵染活性的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp niveum（E.F.Smith）Snyder Hansen），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供；萬壽菊殺菌素水乳劑，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院相關(guān)課題組研制合成。

1.2 方法

1.2.1 PDA 液體培養(yǎng)基 稱取去皮切塊土豆200 g，加水1 000 mL 煮沸30 min，雙層紗布過濾，補(bǔ)充水分至1 000 mL，分裝在10 個(gè)100 mL 三角瓶中，每個(gè)三角瓶分別加入2 g 的葡萄糖，用牛皮紙封口，于121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 在5 個(gè)250 mL 的無菌三角瓶中分別加入100 mL PDA 液體培養(yǎng)基，加入2個(gè)直徑為6 mm 的菌餅接種，于25 ℃，120 r/min培養(yǎng)60 h。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)CK 和A，B，C，D 共5個(gè)處理，即每個(gè)三角瓶的菌液中分別按照終濃度0，0.1，0.2，0.3，0.4 μg/mL 加入相應(yīng)量的萬壽菊殺菌素水乳劑，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.4 尖孢鐮刀菌電導(dǎo)值的測定 每隔24 h 取培養(yǎng)液5 mL，3 000 r/min 離心15 min，棄上清液，稱取0.5 g 菌絲體（沉淀），用去離子水反復(fù)沖洗3 次后，加去離子水10 mL，靜置30 min，測定電導(dǎo)值[5-6]。用電導(dǎo)值的變化衡量細(xì)胞膜透性的變化。

1.2.5 尖孢鐮刀菌纖維素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性的測定 每隔24 h 按照李合生[7]的方法進(jìn)行尖孢鐮刀菌纖維素酶活性和β-D- 葡萄糖苷酶活性的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊殺菌素水乳劑對尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜透性的影響

不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素水乳劑處理尖孢鐮刀菌后，尖孢鐮刀菌菌膜透性的變化如圖1所示。尖孢鐮刀菌菌膜電導(dǎo)值的變化直接反映了其細(xì)胞膜的通透程度。

從圖1 可以看出，同一處理時(shí)間下，電導(dǎo)值大小為處理D＞C＞B＞A＞CK，即隨著萬壽菊殺菌素水乳劑質(zhì)量濃度的逐漸增加，電導(dǎo)值也隨之增大。說明萬壽菊殺菌素水乳劑作用于尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜會增加細(xì)胞膜的通透性，引起電解質(zhì)外滲，進(jìn)而抑制尖孢鐮刀菌的生長。

2.2 萬壽菊殺菌素水乳劑對尖孢鐮刀菌侵染力的影響

2.2.1 萬壽菊殺菌素水乳劑對尖孢鐮刀菌纖維素酶活性的影響 圖2 為萬壽菊殺菌素水乳劑處理后，尖孢鐮刀菌纖維素酶活性的變化情況。

從圖2 可以看出，隨著對照組尖孢鐮刀菌不斷的增殖，其纖維素酶活性也呈現(xiàn)出緩慢增長，在72 h 后呈現(xiàn)出基本平穩(wěn)的水平波動趨勢；而萬壽菊殺菌素水乳劑處理的A，B，C，D 的纖維素酶水平則呈現(xiàn)出起伏不定，但是總體水平明顯低于對照，且隨著萬壽菊殺菌素水乳劑添加量的增加，纖維素酶活性降低得越明顯。說明萬壽菊殺菌素水乳劑可以降低纖維素酶活性。

2.2.2 萬壽菊殺菌素水乳劑對尖孢鐮刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性的影響 圖3 為萬壽菊殺菌素水乳劑處理對尖孢鐮刀菌β-D- 葡萄糖苷酶活性的影響。

從圖3 可以看出，隨著對照組尖孢鐮刀菌不斷的增殖，其β-D- 葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)出緩慢增長的趨勢。而萬壽菊殺菌素水乳劑處理的A，B，C，D 的β-D- 葡萄糖苷酶活性隨處理時(shí)間的增加呈下降趨勢，與對照組相比，明顯下降，且隨著萬壽菊殺菌素水乳劑添加量的增加，β-D- 葡萄糖苷酶活性降低得越明顯。說明萬壽菊殺菌素水乳劑可以降低β-D- 葡萄糖苷酶活性。

3 討論

長期使用傳統(tǒng)農(nóng)藥對環(huán)境造成污染，給推動農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來很多的不利影響[8]。本試驗(yàn)表明，萬壽菊殺菌素水乳劑作為一種生物農(nóng)藥，能夠使尖孢鐮刀菌膜的透性增加，即當(dāng)病原菌細(xì)胞膜的透性被破壞，病原菌菌體生物質(zhì)膜功能受損，進(jìn)一步會引起病原菌細(xì)胞功能紊亂[9]，最終導(dǎo)致其活力降低，侵染活性也隨之下降。

植物細(xì)胞壁是防止病原菌入侵的天然屏障，這種天然屏障需要有專門的酶類來降解[10]。當(dāng)病原菌與植物相互作用時(shí)，在細(xì)胞壁組分的誘導(dǎo)下，產(chǎn)生一些與細(xì)胞壁降解有關(guān)的酶類，它們在侵染寄主致病的過程中起到至關(guān)重要的作用[11]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性水平的高低與尖孢鐮刀菌的侵染力強(qiáng)弱呈現(xiàn)一定程度的關(guān)聯(lián)[10]，而且β-D- 葡萄糖苷酶活性越高，則分解細(xì)胞壁的速度會越快[12]。本研究表明，萬壽菊殺菌素水乳劑可以降低纖維素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性，且隨著萬壽菊殺菌素水乳劑添加量的增加，這2 類酶活性的降低越明顯。說明萬壽菊殺菌素水乳劑可通過降低細(xì)胞壁降解酶類的活性而降低尖孢鐮刀菌的侵染活性。

總之，萬壽菊殺菌素水乳劑能夠通過對尖孢鐮刀菌膜透性的影響以及對植物與病原菌相互作用產(chǎn)生降解細(xì)胞壁酶類的影響，使尖孢鐮刀菌侵染活性下降，從而起到抑菌和保護(hù)植物的作用。

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