魏 巍，許艷麗，劉金波，韓曉增

(1. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點實驗室，海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外觀測研究站，黑龍江哈爾濱150081;2. 中國科學(xué)院研究生院，北京100049)

鐮孢菌屬真菌(Fusarium spp. )是土壤真菌的主要類群。其可以侵染寄主植物的維管束系統(tǒng)和器官，從而引起植物萎蔫和根、莖、葉和果實腐爛等癥狀［1］，因此該屬真菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物萎蔫病和根腐病的主要病原菌。由其引發(fā)的病害可降低農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)，甚至導(dǎo)致大量減產(chǎn)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最難防治的土傳病害［1－2］。近年來，為降低鐮孢菌病害帶來的損失，廣泛提倡結(jié)合化學(xué)藥劑拌種［3－4］、應(yīng)用輪作以及保護(hù)性耕作等農(nóng)藝措施［5－6］，施用生防菌［7］等方法改善土壤鐮孢菌種群分布，進(jìn)而緩解病害發(fā)生的程度。施肥作為重要的農(nóng)業(yè)管理措施，可以通過直接影響土壤中的化學(xué)成分，引起土壤微生物活性和群落結(jié)構(gòu)改變［8］;還可以通過改變土壤物理性狀，進(jìn)而影響地上植被的生長及地下根系發(fā)育及其分泌，從而間接地影響土壤微生物群落［9］。然而，長期施肥措施對土壤中鐮孢菌種群的影響等方面的研究，還鮮見報道。

土壤中鐮孢菌種群密度的研究多采用稀釋平板法等傳統(tǒng)研究手段，而傳統(tǒng)方法的局限性使其無法全面反映自然條件下鐮孢菌的種群密度，從而使結(jié)果產(chǎn)生偏差。實時熒光定量PCR (real－time quantitative polymerase chain reaction，Real－Time QPCR)技術(shù)的提出，為植物病原菌檢測提供了全新的方法，即通過實時監(jiān)測病原菌目的序列的PCR 擴增產(chǎn)物的熒光信號強度并進(jìn)行解析的方法［10］。目前，國內(nèi)外研究者根據(jù)植物保護(hù)學(xué)領(lǐng)域中病害診斷和病原菌檢測等方面的需要，廣泛地使用簡便易行、成本較低的熒光嵌合法，選擇SYBR GreenⅠ和Eva Green 等熒光染料對環(huán)境樣品中的鐮孢菌進(jìn)行絕對定量分析［11－13］。

應(yīng)用傳統(tǒng)定量方法和Real－Time QPCR 定量方法對黑土大豆田土壤鐮孢菌種群密度進(jìn)行了研究，旨在對比兩種定量研究方法的同時，建立土壤鐮孢菌屬種群密度的Real－Time QPCR 研究體系。通過對3 種施肥措施下土壤鐮孢菌屬種群密度動態(tài)的研究，探討不同施肥措施對土壤鐮孢菌種群密度動態(tài)的影響，以期從科學(xué)施肥角度為如何改善土壤鐮孢菌種群分布，降低鐮孢菌病害發(fā)生提供補充及參考。

1 材料與方法

1.1 樣地設(shè)置

試驗設(shè)在中國科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站(47°26'N，126°38'E)長期定位試驗區(qū)。該試驗區(qū)地處于溫帶大陸性季風(fēng)氣候的東北黑土區(qū)中部，冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨，雨熱同季。年平均氣溫1.5 ℃，年均降水量570 mm，年均有效積溫2 400 ℃。土壤類型為中厚層黑土，開墾前為草甸草原植被，開墾歷史為100 a 左右。于1993 年將農(nóng)田設(shè)3 個施肥處理:無肥處理(No Fertilizer，NF)、化肥處理(NP chemical fertilizer，NP)和化肥配施有機肥處理(NP chemical fertilizer and organic manure，NPM)。施肥量為N 32.26 kg·hm－2、P2O582.44 kg·hm－2、有機肥15 000 kg·hm－2，有機肥為腐熟豬糞［14－15］。土壤理化性質(zhì)如表1 所示。種植方式為小麥－玉米－大豆輪作，研究取樣時農(nóng)田作物為大豆。

1.2 樣品采集

樣品采集于2008 年大豆田3 種施肥措施下的土壤，時間對應(yīng)大豆的5 個生育時期:播前期(5 月13日)、苗期(6 月13 日)、花期(7 月13 日)、鼓粒期(8 月8 日)和成熟期(9 月28 日)。采用土鉆按五點取樣法采集非根際土壤，同時為避免空氣對土壤表層的影響，去除0～5 cm 處的表土，采集5 cm～20 cm 深度的土壤樣品?；旌暇鶆蚝笥脽o菌封口袋包扎密封，置于冰盒中帶回實驗室。新鮮土樣過2 mm 土壤篩后分成3 份，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 土壤鐮孢菌傳統(tǒng)定量研究

土壤鐮孢菌的傳統(tǒng)定量研究結(jié)合土壤稀釋平板法和形態(tài)學(xué)鑒定方法進(jìn)行。取10g 土壤樣品，加入100ml 無菌水中，制成10－1稀釋液。室溫，120 rpm 震蕩20 min 后靜止10 min，取上清液依次制成10－2和10－3稀釋液。無菌條件下分別取3 個稀釋度的溶液0.5 ml 涂勻于PPA 培養(yǎng)基平板上［16］，各3 次重復(fù)。25℃培養(yǎng)3 d～5 d，選擇代表性稀釋度進(jìn)行CFU 計數(shù)。再將該稀釋度下生長的全部菌落轉(zhuǎn)到PDA 平板上，經(jīng)25℃光照與黑暗交替培養(yǎng)4 d 后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定［17－18］，最終確定該稀釋度下鐮孢菌屬真菌數(shù)量并統(tǒng)計單位土壤中鐮孢菌數(shù)量。

1.4 土壤鐮孢菌Real－Time QPCR 定量研究

1.4.1 土壤微生物基因組總DNA 及Real－Time QPCR 標(biāo)準(zhǔn)品尖鐮孢菌基因組總DNA 提取。應(yīng)用美國Omega 公司的土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒提取土壤微生物基因組總DNA，提取過程按照說明手冊進(jìn)行。Real－Time QPCR 應(yīng)用經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定及單孢分離得到的尖鐮孢菌Fusarium oxysproum 的基因組DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品。鐮孢菌純菌基因組總DNA 的提取參考李志崗等方法［19］。提取到的DNA 均使用大連寶生物公司生產(chǎn)的TAE 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進(jìn)行純化。純化后總DNA 通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗。

1.4.2 Real－Time QPCR 擴增反應(yīng)引物及條件。應(yīng)用鐮孢菌屬特異性引物TR 和TS 進(jìn)行Real－Time QPCR 檢測，其擴增片段位于鐮孢菌ITS 基因上，長度為170 bp［20］。序列分別為上游引物TR:5＇－TTC GTG ATA CCA AAG GGA C－3＇和下游引物TS:5＇－CCA CAA GGG CAG CAA CGG－3＇。

Real－Time QPCR 應(yīng)用Bio－Rad 公司MJ Opticon Monitor 熒光定量PCR 儀進(jìn)行。反應(yīng)體系體積為25 μL，其中10 ×PCR Buffer 2 μL，MgCl2(200 mmol·L－1)2 μL，dNTP (10 mmol·L－1)2 μL，上、下游引物(20 pmol·L－1)各1 μL，Taq 酶0.3 μL，EVA GreenⅠ2 μL，DNA (20 ng·μL－1)提取物2 μL，最后加去離子水補足。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性10 s，56.6℃退火30 s，72℃延伸20 s，并收集熒光信號，40 個循環(huán);72℃5 min。熔點曲線分析溫度設(shè)于65℃～95℃之間，每隔0.2℃收集熒光信號1 s。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用MJ Opticon Monitor TM 3.1 實時熒光定量分析軟件和DPS 7.55 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soilsg·kg －1

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤鐮孢菌傳統(tǒng)定量研究

稀釋平板法計數(shù)3 種施肥措施下土壤鐮孢菌數(shù)量的結(jié)果顯示，圖1。在大豆生育期中的播前期、苗期、花期、鼓粒期和成熟期5 個時期，3 種施肥措施下土壤鐮孢菌屬數(shù)量呈現(xiàn)出不同的動態(tài)變化趨勢。其中，無肥措施(NF)鐮孢菌數(shù)量變化趨于平穩(wěn)，在花期達(dá)到數(shù)量峰值。但該峰值與其它時期土壤鐮孢菌數(shù)量間差異不顯著(p ＞0.05)。施用化肥(NP)和化肥配施有機肥(NPM)措施土壤鐮孢菌數(shù)量變化趨勢相似，均為由苗期開始數(shù)量逐漸上升，達(dá)到各自的峰值后再分別有所下降。不同的是NP 措施在花期達(dá)到了峰值，而NPM 措施在苗期達(dá)到了峰值。然而，NP 和NPM 措施土壤鐮孢菌數(shù)量峰值與二者其它時期土壤鐮孢菌數(shù)量間同樣為差異不顯著(p ＞0.05)。

圖1 不同施肥措施土壤鐮孢菌CFU 數(shù)量動態(tài)Fig.1 Dynamics of the CFU of soil Fusarium spp. in different fertilization managements

2.2 土壤鐮孢菌Real－Time QPCR 定量研究

2.2.1 Real－Time QPCR 定量研究體系建立。研究中選取尖孢鐮孢菌基因組DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定該標(biāo)準(zhǔn)品原始溶液DNA 濃度為58.8 ng·μL－1。利用MJ Opticon Monitor TM 3.1 軟件繪制出反應(yīng)后的熔點曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。熔點曲線無雜峰，圖2，表明擴增反應(yīng)產(chǎn)物單一且無引物二聚體。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.991，斜率為－0.301 4，計算其擴增效率E=101%，圖3。

2.2.2 土壤鐮孢菌DNA 含量動態(tài)研究 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率及C (t)值，由MJ Opticon Monitor TM 3.1軟件計算出樣品組DNA 含量，并繪制其動態(tài)變化曲線，圖4。在大豆生育期中的播前期、苗期、花期、鼓粒期和成熟期5 個時期，3 種施肥措施下土壤鐮孢菌屬DNA 含量動態(tài)變化趨勢均為由苗期開始隨著大豆生育期逐漸上升，達(dá)到各自的峰值后再分別下降。其中，無肥措施土壤鐮孢菌DNA 含量在花期達(dá)到峰值，每克干土中含量為99.61 pg。該峰值與播前期、苗期和成熟期土壤鐮孢菌DNA 含量間差異極顯著(p＜0.01)，而與隨后的鼓粒期土壤鐮孢菌DNA 含量差異不顯著(p ＞0.05)，同時播前期和苗期間差異也不顯著(p ＞0.05)。各生育時期土壤鐮孢菌DNA 含量間的差異程度說明在不施用肥料的條件下，土壤鐮孢菌DNA 含量經(jīng)過播前期的過渡，由苗期開始急劇升高，并在花期達(dá)到最大，隨后在鼓粒期和成熟期又迅速地下降。

圖2 Real－Time QPCR 反應(yīng)中標(biāo)準(zhǔn)品熔點曲線Fig.2 The melting curve of standard substrate in real－time QPCR

圖3 Real－Time QPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of real－time QPCR

圖4 不同施肥措施土壤鐮孢菌DNA 含量動態(tài)Fig.4 Dynamics of the genetic DNA of soil Fusarium spp. in different fertilization managements

施用化肥(NP)后，土壤鐮孢菌DNA 數(shù)量達(dá)到最大的時期仍然是花期，但其峰值較無肥措施有所下降，每克干土中含量為77.09 pg。該峰值與苗期和鼓粒期土壤鐮孢菌DNA 含量間差異以及播前期和苗期間差異均達(dá)到極顯著水平(p ＜0.01)，而鼓粒期和成熟期間的差異則不顯著(p＞0.05)，且除苗期外的各時期數(shù)值均低于無肥措施。這說明NP 的施用盡管沒有改變土壤中鐮孢菌DNA 的時間分布趨勢，但卻在總體上降低了其在土壤中的含量。同時也改變了初期(播前期)鐮孢菌DNA 數(shù)量的增長速度，從播前期即開始迅速地上升。花期過后迅速下降，到鼓粒期時趨于平穩(wěn)。

施用化肥配施有機肥(NPM)后，土壤鐮孢菌DNA 數(shù)量出現(xiàn)峰值的時期發(fā)生改變，提前至苗期，每克干土中含量達(dá)到140.83 pg，且遠(yuǎn)高于同時期的另外2 種施肥措施(p ＜0.01)。該峰值與播前期土壤鐮孢菌DNA 含量間差異達(dá)到極顯著水平(p ＜0.01)，而與花期間的差異并不顯著(p ＞0.05)。這說明在改施NPM 后，土壤中鐮孢菌DNA 的時間分布趨勢發(fā)生了變化。其土壤中的含量在播前期開始急劇地上升，苗期達(dá)到最大并將此狀態(tài)保持到了花期，隨后才開始下降。同時5 個生育時期的土壤中鐮孢菌DNA 數(shù)量均高于同期其它施肥方式，由此可見NPM 的施用可以顯著地增加土壤中鐮孢菌DNA 的含量。

比較苗期3 種施肥措施土壤中鐮孢菌DNA 總含量，NPM 措施含量最高，每克干土中含量達(dá)到140.83 pg 。其次為NP 措施，含量為44.61 pg。無肥措施最低，僅為18.33 pg。并且3 種措施相互間的差異均達(dá)到極顯著水平。該結(jié)果說明大豆田土壤采取NP 或NPM 措施，均可極顯著地增加苗期土壤鐮孢菌DNA 含量。其中，NPM 措施甚至可以將土壤鐮孢菌DNA 含量提升1 個數(shù)量級。由此可見，施肥措施的不同，不僅可以影響土壤鐮孢菌DNA 的含量，甚至可以改變其時間分布規(guī)律。

3 討論

傳統(tǒng)定量方法研究大豆田土壤鐮孢菌種群密度結(jié)果表明，3 種施肥措施土壤鐮孢菌種群密度對應(yīng)大豆生育時期的動態(tài)變化均不顯著(p ＞0.05)。施肥有利于提高土壤微生物數(shù)量，特別是化肥與有機肥配施可明顯增加土壤的微生物數(shù)量［8］，而上述土壤鐮孢菌種群密度變化不顯著的結(jié)果很可能是由于傳統(tǒng)稀釋平板法所具有的限制作用造成的。長期以來，土壤鐮孢菌種群密度的研究一直借助于稀釋平板法等傳統(tǒng)研究手段。雖然稀釋平板法憑借操作簡便、快捷和易成功等優(yōu)點［21］，成為土壤微生物分離培養(yǎng)及衡量微生物小群體多樣性的常規(guī)手段，但是該方法也存在很多缺陷，例如培養(yǎng)基的成份可以影響微生物的生長狀況，進(jìn)而影響所得菌落的多樣性水平;菌落形成單位(CFU)的數(shù)量通常隨培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度的降低而增加［22］。因此其無法全面反映自然條件下微生物的生長狀況，從而使結(jié)果產(chǎn)生偏差。另一方面，土壤中鐮孢菌可以通過大型分生孢子、小型分生孢子、厚垣孢子以及菌絲段等方式進(jìn)行繁殖。因此通過稀釋平板法分離培養(yǎng)出的鐮孢菌，其來源可能是土壤中尚未生長的大、小分生孢子、厚垣孢子甚至是稀釋及接種過程中產(chǎn)生的菌絲段，所以無法真實地反映出自然條件下鐮孢菌的數(shù)量，致使該方法在進(jìn)行大量樣品中鐮孢菌種群密度分析和后續(xù)研究時成為一個可能的限制因子。因此，尋找更適合的土壤鐮孢菌種群密度的研究方法變得尤為重要。

Real－Time QPCR 反應(yīng)的得到的熔點曲線無雜峰，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.991，斜率為－0.301 4，均達(dá)到Real－Time QPCR 反應(yīng)的理想條件，并對不同施肥措施土壤中鐮孢菌DNA 含量進(jìn)行了絕對定量分析。建立Real－Time QPCR 檢測體系的最大困難除了引物應(yīng)具有良好的特異性外，標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立同樣至關(guān)重要。由于Real－Time QPCR 絕對定量是建立在模板的初始濃度與Ct 值關(guān)系的基礎(chǔ)上，因此為保證樣本定量分析具有穩(wěn)定可重復(fù)的結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)的要求非常嚴(yán)格。理論上一條合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有3個特點:一致的重復(fù)反應(yīng)、高的線性(R2＞0.99)和高擴增效率(E:90%～105%，即斜率≈－0.3)。其中，擴增效率大于100%的原因可能是由于反應(yīng)抑制劑的存在所造成的。反應(yīng)抑制劑能夠延遲反應(yīng)Ct值，但隨著標(biāo)準(zhǔn)品樣品模板的稀釋，其濃度逐漸減小，因此在高稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品樣品中反應(yīng)抑制劑對Ct 值的延遲程度也在減弱，導(dǎo)致高稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品樣品Ct 值略微增高，進(jìn)而造成擴增效率計算結(jié)果略微大于100%。由于研究中作為標(biāo)準(zhǔn)品的鐮孢菌基因組DNA 的提取過程中應(yīng)用了可以成為反應(yīng)抑制劑的化學(xué)藥品，如氯仿、飽和酚等［11］，所以導(dǎo)致結(jié)果中擴增效率為101%。研究中應(yīng)用的引物擴增已分離鐮孢菌菌株的序列大小一致，且無引物二聚體及非特異性擴增出現(xiàn)。因此得出的DNA 質(zhì)量結(jié)果與鐮孢菌個體數(shù)呈正向相關(guān)，即可以通過土壤中鐮孢菌DNA 含量間的差異來反映不同施肥措施間土壤鐮孢菌種群密度的差異。該方法不經(jīng)過分離培養(yǎng)過程，可以克服上述傳統(tǒng)稀釋平板法的局限性，同時還具有快捷、省力等優(yōu)勢。

在大豆根部病害高發(fā)的苗期，3 種施肥措施下土壤鐮孢菌總DNA 在每克干土中質(zhì)量(Q)由高到低的順序為QNPM＞QNP＞QNF。李海波等(2007)研究表明農(nóng)田不施肥，有機質(zhì)含量顯著下降;單施化肥或高量化肥可使有機C、N 庫保持穩(wěn)定或小幅波動;化肥和有機肥配合施用則能提高有機質(zhì)含量，改善土壤質(zhì)量，提高土壤肥力［23］。因此，大豆田土壤施入化肥配施有機肥(NPM)后，能明顯提高土壤有機質(zhì)養(yǎng)分含量，增強土壤酶活性，增加土壤微生物的數(shù)量，創(chuàng)造有利于土壤微生物生長繁育的土壤生態(tài)化學(xué)環(huán)境［22］。土壤鐮孢菌的正常生長繁殖同樣需要土壤有機質(zhì)作為養(yǎng)分，因此土壤有機質(zhì)含量與土壤鐮孢菌種群密度應(yīng)存在正向相關(guān)關(guān)系，這也很可能是大豆田土壤鐮孢菌DNA 含量在NPM 措施中最高的原因。然而土壤中有機質(zhì)的補充不僅有利于土壤微生物的生長繁殖，還可以顯著地提高土壤微生物得多樣性水平，使土壤抑制土傳植物病害能力提高［24］。已有研究表明，土壤中鐮孢菌屬不僅包含了大量的植物致病種，其屬內(nèi)的非致病種的營腐生性特性使其可以成為某些致病鐮孢菌的生防菌株［25］。因此，盡管在NPM 措施下大豆田土壤鐮孢菌DNA 含量高，種群密度大，但同樣由于土壤有機質(zhì)的作用，使其種群多樣性水平較無肥措施更為豐富，抑制了致病性鐮孢菌的生長，從而提高了土壤自身對大豆根腐病原鐮孢菌的抑制能力。然而該結(jié)論仍需結(jié)合對大豆田土壤鐮孢菌種群多樣性研究加以證明。

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