蔡 誠，王園朝，鄧 飛

（杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，有機(jī)硅化學(xué)及材料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310036）

尼卡地平、尼莫地平和尼群地平毛細(xì)管電泳手性拆分研究

蔡 誠，王園朝，鄧 飛

（杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，有機(jī)硅化學(xué)及材料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310036）

文章以環(huán)糊精及其衍生物為手性試劑，研究了血管擴(kuò)張型降壓藥鹽酸尼卡地平、尼莫地平和尼群地平手性對(duì)映體拆分方法.采用區(qū)帶毛細(xì)管電泳模式，以高磺化環(huán)糊精（HS－CD）為手性識(shí)別試劑，考察了手性試劑的類型、濃度及緩沖溶液pH值等對(duì)分離度的影響，確定了拆分尼卡地平、尼莫地平和尼群地平手性對(duì)映體的最佳條件.結(jié)果表明鹽酸尼卡地平在HS－γ－CD手性選擇劑存在下對(duì)映體獲得基線分離，尼莫地平和尼群地平分別在HS－β－CD和HS－α－CD手性選擇劑存在下對(duì)映體獲得部分分離，并對(duì)其分離機(jī)理進(jìn)行了初步探討.

毛細(xì)管區(qū)帶電泳；高磺化環(huán)糊精；手性對(duì)映體拆分；鹽酸尼卡地平；鹽酸尼莫地平；鹽酸尼群地平

尼卡地平（Nicardipine，NCD）、尼莫地平（Nimodipine，NMD）和尼群地平（Nitrendipine，NTD）屬第二代1，4－二氫吡啶類鈣拮抗劑（DPHs），通過抑制細(xì)胞外Ca的內(nèi)流、松弛血管平滑肌而起到降壓作用，用于低、中度高血壓病.結(jié)構(gòu)中二氫吡啶環(huán)上的4位C為不對(duì)稱碳原子（見圖1），存在兩個(gè)對(duì)映體，因在藥理活性上存在著明顯差異［1－2］，對(duì)映體分離已引起人們廣泛關(guān)注.目前對(duì)尼卡地平、尼莫地平和尼群地平的手性分離大多是利用HPLC方法，分離柱手性固定相主要有直鏈淀粉衍生物［3］、大環(huán)抗生素類［4］、多糖及纖維素類［5］、卵類粘蛋白［7］和卵類糖蛋白［8］等.毛細(xì)管電泳在手性分離方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，其手性分離的關(guān)鍵是手性試劑的選擇，環(huán)糊精因其特殊的空穴結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于手性物質(zhì)的分離.在此選擇羥丙基和高磺化兩種類型環(huán)糊精衍生物為緩沖溶液手性添加劑，試驗(yàn)了上述3種結(jié)構(gòu)類似藥物對(duì)映體分離條件，基線分離了尼卡地平，部分分離了尼莫地平和尼群地平手性對(duì)映體，并對(duì)其分離機(jī)理進(jìn)行了初步的討論.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀，PDA檢測器，32Karat軟件（美國Beckman公司）；熔融石英毛細(xì)管裸柱，60cm×50μm，有效長度為49cm（美國Beckman公司）.

羥丙基－α，β，γ－環(huán)糊精（HP－α，β，γ－CD）（Fluka）、高磺化－α，β，γ－環(huán)糊精（HS－α，β，γ－CD）（Beckman）；鹽酸尼卡地平、鹽酸尼莫地平和鹽酸尼群地平對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所），配成濃度為1.0mg·mL－1的水溶液，1，3，6，8－pyrenetetrasulfonate（PTS）作標(biāo)記物；其余試劑均為分析純，水為去離子水.

圖1 尼卡地平（Ⅰ）、尼莫地平（Ⅱ）和尼群地平（Ⅲ）的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structures of Nicardipine（Ⅰ）、Nimodipine（Ⅱ）and Nitrendipine（Ⅲ）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 運(yùn)行緩沖溶液的制備

于一小燒杯中取20%HS－α（β，γ）－CD水溶液5mL，水5mL和100mmol·L－1H3PO4溶液10mL，在pH計(jì)上用三乙胺調(diào)到所需pH值.即可得到含5%HS－α（β，γ）－CD的50mmol·L－1三乙胺磷酸鹽緩沖溶液.使用前用0.22μm針筒過濾器過濾.

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取10.0mg鹽酸尼卡地平、鹽酸尼群地平，用少量甲醇溶解后，配成10mL的甲醇/水溶液，即得濃度為1.0mg·mL－1的貯備液，鹽酸尼莫地平貯備液濃度為0.5mg·mL－1.置于冰箱中4℃保存.1.2.3 樣品溶液的制備

分別取200μL濃度為1.0mg·mL－1鹽酸尼卡地平、尼群地平和0.5mg·mL－1尼莫地平貯備液，加入2μL PTS混勻，置于儀器樣品小管中即可.

1.2.4 毛細(xì)管柱處理方法

毛細(xì)管使用前用0.1mol·L－1NaOH溶液和水分別沖洗2min，運(yùn)行緩沖溶液沖洗2min.兩次進(jìn)樣間依次用0.1mol·L－1NaOH溶液、水和緩沖溶液各沖洗1min.

1.2.5 電泳條件

運(yùn)行緩沖溶液含5%HS－α（β，γ）－CD的50mmol·L－1三乙胺磷酸鹽（pH 2.5）；工作電壓：－15kV（反向電壓）；檢測波長：200nm，柱溫：25℃；3kPa壓力進(jìn)樣4s.

2 結(jié)果與討論

2.1 手性試劑的選擇

實(shí)驗(yàn)分別選擇了HP－α，β，γ－CD和HS－α，β，γ－CD為手性選擇劑.在加正向分離電壓（8－15kV）和pH6－9范圍內(nèi)，試驗(yàn)了HP－α，β，γ－CD對(duì)3種手性藥物對(duì)映體的拆分效果，結(jié)果顯示3種手性藥物對(duì)映體均未獲得明顯的手性拆分，而在反相電壓和低pH值條件下，HS－α，β，γ－CD對(duì)3種藥物對(duì)映體的手性拆分都有明顯的效果，只是分離程度表現(xiàn)不同.其中常溫（25℃）下尼卡地平在HS－γ－CD中手性分離效果最好，但溫度升高時(shí)，在HS－α－CD和HS－β－CD中也能獲得較好的手性分離效果；尼莫地平只在HS－β－CD中手性分離效果最好；尼群地平只在HS－α－CD中手性分離效果最好.實(shí)驗(yàn)以尼卡地平為對(duì)象，選擇HS－γ－CD為手性試劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了探討.

2.2 緩沖溶液濃度及pH值對(duì)對(duì)映體分離度的影響

以HS－γ－CD為手性試劑，固定緩沖溶液pH值和磷酸鹽濃度，分別以磷酸鹽、磷酸鹽－tris和磷酸鹽－三乙胺進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單純的磷酸鹽為運(yùn)行緩沖溶液時(shí)電流較大，焦耳熱效應(yīng)明顯，譜峰拓展峰形拖尾；磷酸鹽－tris為緩沖溶液時(shí)，抑制了電流，使峰遷移時(shí)間過長，分離效果不理想；磷酸鹽－三乙胺作緩沖溶液時(shí)，遷移時(shí)間適中，基線穩(wěn)定，峰形好且分離效果好.在20～70mmol·L－1范圍內(nèi)，改變緩沖溶液濃度，表明在50mmol·L－1時(shí)，對(duì)映體分離效果最好.考慮到手性試劑與尼卡地平的充分作用，實(shí)驗(yàn)選擇在較強(qiáng)酸性條件下進(jìn)行，此時(shí)毛細(xì)管內(nèi)壁硅羥基的離解被抑制，基本消除了電滲流，溶質(zhì)主要依賴于自身電泳速度遷移.試驗(yàn)了pH值從1～4范圍內(nèi)變化對(duì)RS的影響，見圖2.當(dāng)pH值較小時(shí)，一方面環(huán)糊精試劑與尼卡地平作用力加強(qiáng)，使分離變好，另一方面分離時(shí)間加長，使譜峰拓寬，分離度減小；當(dāng)pH值較大時(shí)，毛細(xì)管壁硅羥基部分離解，有吸附現(xiàn)象基線不好，分離效果變差；當(dāng)pH為2.5時(shí)，基線穩(wěn)定，且RS最好.故選擇50mmol·L－1三乙胺磷酸鹽（pH2.5）為運(yùn)行緩沖溶液.

2.3 HS－γ－CD濃度對(duì)對(duì)映體分離度的影響

HS－γ－CD濃度對(duì)鹽酸尼卡地平對(duì)映體分離度（RS）的影響見圖3.隨著選擇劑HS－γ－CD濃度的增大，分離度增加，但同時(shí)離子強(qiáng)度增加，焦耳熱效應(yīng)增大.當(dāng)HS－γ－CD%＜5%（W/V）時(shí)，試劑與尼卡地平作用力較弱，而且此時(shí)緩沖體系粘度較小，遷移時(shí)間變短，導(dǎo)致分離不完全；當(dāng)HS－γ－CD%＞5%（W/V）時(shí)，濃度對(duì)分離度影響程度減弱，濃度太高，緩沖體系粘度較大，分離時(shí)間變長，峰形變寬.因此選擇5%HS－γ－CD為最佳手性試劑濃度.

2.4 分離電壓對(duì)對(duì)映體分離度的影響

柱溫為25℃時(shí)，分離電壓在10～25kV范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)分離電壓大于20kV時(shí)，因焦耳熱效應(yīng)的影響，譜峰變寬，尼卡地平未能達(dá)到基線分離；而當(dāng)電壓低于15kV時(shí)，分離時(shí)間變長，峰形拖尾，實(shí)驗(yàn)選擇15kV為最佳分離電壓.

2.5 分離譜圖

最佳條件下，鹽酸尼卡地平、鹽酸尼莫地平和鹽酸尼群地平分別在HS－γ－CD、HS－β－CD和HS－α－CD手性選擇劑存在下的對(duì)映體分離譜圖（如圖4所示）.尼卡地平的兩個(gè)手性對(duì)映體在HS－γ－CD中獲得了基線分離，而尼莫地平和尼群地平均未獲得基線分離.

圖4 尼卡地平（a）、尼莫地平（b）和尼群地平（c）的手性對(duì)映體拆分電泳圖Fig.4 Chiral seperation electropherogram of Nicardipine（a）、Nimodipine（b）and Nitrendipine（c）

2.6 手性識(shí)別機(jī)理討論

一般認(rèn)為環(huán)糊精對(duì)分子手性拆分的機(jī)理主要有兩個(gè)方面，其一是環(huán)糊精杯狀結(jié)構(gòu)內(nèi)腔尺寸大小的空間匹配作用，其二是環(huán)糊精外緣端－OH與手性分子間的氫鍵作用.但在以前的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在低pH值條件下叔胺類藥物與高磺化環(huán)糊精之間還存在一定的靜電引力作用，有時(shí)靜電引力作用對(duì)手性對(duì)映體的拆分起著決定性的作用［9］.該實(shí)驗(yàn)中尼卡地平、尼莫地平和尼群地平分別在HS－γ－CD、HS－β－CD和HS－α－CD中獲得較好的手性拆分效果，這是環(huán)糊精與客體空間匹配作用的結(jié)果.但尼卡地平在升溫條件下（35℃），以HS－α（β）－CD為手性選擇劑時(shí)，也可獲得好的拆分效果，而其它兩種物質(zhì)沒有此現(xiàn)象.這是因?yàn)楹惺灏被哪峥ǖ仄?，酸性條件下能獲得一個(gè)質(zhì)子成為季胺鹽而帶正電，可與高磺化環(huán)糊精中－SO－3產(chǎn)生靜電引力作用.溫度較高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)速率加快，主客體間的空間匹配和氫鍵作用影響減弱，靜電引力作用在手性對(duì)映體拆分中起主要影響作用.

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Study on the Enantiomeric Separation of Nicardipine，Nimodipine and Nitrendipine by Capillarary Electrophoresis

CAI Cheng，WANG Yuan－chao，DENG Fei

（College of Material，Chemistry and Chemical Engineering，Key Laboratory of Organosilicon Chemistry and Material Technology of Ministry of Education，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

Enantioseparation methods of antihypertensive vasodilator nicardipine，nimodipine and nitrendipine were studied using cyclodextrin and its derivatives as chiral reagents.Many factors such as the type of chiral reagent and its concentration，pH of buffer on resolution（Rs）were investigated using high sulfonated cyclodextrin（HS－CD）as chiral recognition reagent with capillary zone electrophoresis，and the optimized conditions of enantioseparation of nicardipine hydrochloride，nimodipine and nitrendipine were defined.The results indicate that nicardipine hydrochloride，nimodipine and nitrendipine are well separated with chiral reagent HS－γ－CD，HS－β－CD and HS－α－CD respectively.The paper discussed their separation mechanisms.

capillary electrophoresis；highly sulfated cyclodextrins；enantioseparation；nicardipine；nimodipine；nitrendipine

R917

A

1674－232X（2012）02－0122－04

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.02.006

2011－04－13

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y406237）；浙江省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2007F70051）.

王園朝（1965—），男，教授，主要從事分子光譜及毛細(xì)管電泳分析方法研究.E－mail：wangyc1819＠126.com