沈 瑩,胡天覺*,曾光明,吳娟娟,黃 超,劉 暉,黃丹蓮,尹 璐 (1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與污染控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410082)

原生質(zhì)體紫外誘變提高簡青霉的木質(zhì)素降解性能

沈 瑩1,2,胡天覺1,2*,曾光明1,2,吳娟娟1,2,黃 超1,2,劉 暉1,2,黃丹蓮1,2,尹 璐1,2(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與污染控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410082)

以簡青霉Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BGA為出發(fā)菌株,對(duì)其進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變.經(jīng)過篩選獲得2株誘變菌株(J12與J18),它們的木質(zhì)素降解酶酶活要明顯高于出發(fā)菌株J.其中誘變菌株J12產(chǎn)生的漆酶和錳過氧化物酶酶活較高,相對(duì)于出發(fā)菌株J分別提高了145%和47%,達(dá)到44.0,50.9 U/g.誘變菌株J18產(chǎn)生的木質(zhì)素過氧化物酶酶活較高,達(dá)到67.1 U/g,相對(duì)于出發(fā)菌株J提高了40%.且木質(zhì)素降解率也最高,相對(duì)于出發(fā)菌株J分別提高了198.1%.經(jīng)過7次傳代, J12和J18的木質(zhì)素降解酶活性保持穩(wěn)定,沒有降低.

簡青霉；誘變；生物降解；木質(zhì)素

木質(zhì)素是一種難降解的天然有機(jī)物質(zhì),大量存在于植物秸稈、木材中,如水稻中木質(zhì)素占秸稈總量的 20%～28%.木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,嚴(yán)重制約了水稻秸稈等農(nóng)業(yè)固體廢物的減量化、資源化和再利用.研究表明,微生物菌種如真菌,通過分泌木質(zhì)素降解酶氧化斷裂木質(zhì)素的化學(xué)鍵,有效降解木質(zhì)素[1-5].木質(zhì)素降解酶主要是指漆酶(Laccase)、木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)和錳過氧化物酶(Mnp).目前生物降解木質(zhì)素的研究大多集中于白腐真菌如黃孢原毛平革菌等,對(duì)簡青霉等軟腐菌在相關(guān)方面的研究報(bào)道較少[6-7].簡青霉的研究報(bào)道多集中于其對(duì)纖維素的降解,而對(duì)于木質(zhì)素的降解僅有少量研究報(bào)道[3-4].作者用篩選得到的一株產(chǎn)生上述 3種重要的木質(zhì)素降解酶的簡青霉(Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BGA)[4]進(jìn)行了原生質(zhì)體制備及紫外誘變育種,研究其對(duì)木質(zhì)素的降解能力.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

簡青霉(P. simplicissimum (Oudem.)Thom BGA),由湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院“863”課題研究組提供[3,4].

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(查氏培養(yǎng)基):NaNO32g, K2HPO41g,KCl 0.5g,MgSO40.5g, FeSO40.01g,蔗糖30g,瓊脂16g,蒸餾水1000mL,pH 6.0,121℃滅菌20min.

菌種保藏培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂16g,蒸餾水1000mL,121℃滅菌20min.

再生固體培養(yǎng)基:NaCl濃度為 0.7mol/L,其他同基礎(chǔ)培養(yǎng)基.

鑒別培養(yǎng)基1(愈創(chuàng)木酚PDA固體培養(yǎng)基):去皮馬鈴薯 200g,葡萄糖 20g,瓊脂 16g,KH2PO33g,MgSO41.5g,蒸餾水 1000mL,滅菌后添加愈創(chuàng)木酚0.4g.

鑒別培養(yǎng)基2(Azure-B培養(yǎng)基)[8]:去皮馬鈴薯 200g,葡萄糖 20g,瓊脂 16g,KH2PO33g, MgSO41.5g,天青-B(Azure-B) 0.1g,蒸餾水1000mL, 121℃滅菌20min.

鑒別培養(yǎng)基 3(RBBR)培養(yǎng)基[9]:去皮馬鈴薯200g,葡萄糖 20g,瓊脂 16g,KH2PO33g,MgSO41.5g,雷瑪唑亮藍(lán)(RBBR)0.625g/L,蒸餾水1000mL,121℃滅菌20min[10].

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:稱取烘干稻草 30g于1000mL錐形瓶中,加入70mL蒸餾水.121℃滅菌20min.

1.3 主要試劑和儀器

蝸牛酶(Snailase)購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;穩(wěn)滲劑:0.7mol/L的NaCl ;RBBR、Azure-B、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、96% 藜蘆醇均購自于Sigma-ALDRICH公司.

紫外-可見光分光光度計(jì)(日本島津公司, UV-2550);光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX61);顯微鏡照像機(jī)(Penguin 600CL,Pixera公司);環(huán)境掃描電鏡(FEI Quanta 200).

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蝸牛酶酶液配制 用 0.7mol/L的 NaCl溶液配制 0.04g/mL濃度的蝸牛酶酶液,經(jīng)0.22um的微孔濾膜過濾除菌.

1.4.2 原生質(zhì)體紫外誘變[11]在無菌操作臺(tái)上,收集處于對(duì)數(shù)期(經(jīng)培養(yǎng) 72h～120h)的簡青霉菌絲體約重 0.1g.將收集好的菌絲體按每 50mg菌絲體加入1mL蝸牛酶酶液的比例混合,37℃保溫2h,用 G3砂芯漏斗過濾去除菌絲碎片.濾液10000r/min離心10min,離心3次,沉淀即為純凈原生質(zhì)體.

將稀釋至濃度為103個(gè)/mL左右的純凈原生質(zhì)體溶液1mL均勻涂布于再生固體培養(yǎng)基平板上(平皿直徑9cm).置于10W的紫外燈下(照射前打開30min使光波穩(wěn)定),距離50cm,于黑暗條件下分別照射 0,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20min.照射完畢后,馬上置于冰箱內(nèi)在低溫條件(-5℃)下暗處理1h.然后,置于34℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每天觀察,待菌落數(shù)穩(wěn)定后記下每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù).

致死率(%)=(未照射的再生菌落數(shù)－照射后的再生菌落數(shù))÷未照射的再生菌落數(shù)×100%

1.4.3 篩選 初篩:挑選在再生平板上長勢(shì)好的或發(fā)生形態(tài)變化的菌落,點(diǎn)植在鑒別培養(yǎng)基上,培養(yǎng) 5d,每天進(jìn)行觀察,根據(jù) RBBR培養(yǎng)基、Azure-B培養(yǎng)基和愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上的生長和褪色情況判斷菌株降解木質(zhì)素的能力.挑選在鑒別培養(yǎng)基上表現(xiàn)好的菌落劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板上,繼續(xù)培養(yǎng) 5d后,重復(fù)鑒別培養(yǎng)和傳代過程,共轉(zhuǎn)7代.

復(fù)篩:挑取傳了7代,并在鑒別培養(yǎng)基上表現(xiàn)好的菌株進(jìn)行生物降解木質(zhì)素的產(chǎn)酶能力和降解性能測定.每隔 5d測一次木質(zhì)素降解酶酶活,到第30d結(jié)束.比較出發(fā)菌株和誘變菌株產(chǎn)最大木質(zhì)素降解酶的酶活,確定誘變菌株產(chǎn)酶性能是否穩(wěn)定.

1.4.4 降解木質(zhì)素能力測定 每瓶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為1×106個(gè)/mL菌懸液10mL.每隔5d從上述培養(yǎng)基中取樣測定漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的酶活.同時(shí)用10g稻草裝瓶,相同條件接種培養(yǎng),測定始末木質(zhì)素、半纖維素和纖維素的含量,用于計(jì)算各組分絕對(duì)量的變化.

1.4.5 粗酶液制備 從固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中取出約2.00g±0.05g的固體樣品,裝入250ml錐形瓶中,并在瓶中加入20mL蒸餾水,稍作振蕩后,放入搖床中 150r/min振蕩浸提 1h;振蕩完畢后 10000 r/min離心10min,上清液可看作除去孢子的粗酶液,用于酶活的測定.

1.4.6 酶活和木質(zhì)素降解率測定 木質(zhì)素過氧化物酶[12]:于310nm測藜蘆醇被氧化成藜蘆醛的光密度變化.反應(yīng)體系包括藜蘆醇(10mmol/L)、H2O2(10mmol/L)、0.1mol/L酒石酸緩沖液(pH 3.0)和粗酶液.定義每min使1μmol的藜蘆醇氧化成藜蘆醛所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U).

錳過氧化物酶[13]:于240nm測Mn2+被氧化成 Mn3+的光密度變化.反應(yīng)體系包括MnSO4(15mmol/L)、H2O2(10mmol/L)、0.05mol/L琥珀酸緩沖液(pH 4.5)和粗酶液.定義每min產(chǎn)生1μmol Mn3+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U).

漆酶[14]:于420nm測ABTS被氧化的光密度變化.反應(yīng)體系包括 ABTS(1.0mmol/L)、100mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)和粗酶液.定義每min轉(zhuǎn)化1μmol的ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U).

采用中性洗滌法、酸性洗滌法和72%硫酸法[15-16]來測定固態(tài)發(fā)酵物中的中性洗滌去除物含量、半纖維素含量、纖維素含量和木質(zhì)素含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 簡青霉生長曲線的測定

從圖1可以看出,第3d到第5d簡青霉菌絲體生長速率最大,是菌絲體生長的對(duì)數(shù)期,故選用這一時(shí)期的菌絲體來制備原生質(zhì)體進(jìn)行誘變.

2.2 簡青霉原生質(zhì)體的制備及再生

在原生質(zhì)體制備的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌齡對(duì)原生質(zhì)體的形成影響很大.當(dāng)菌絲體處于對(duì)數(shù)期時(shí),原生質(zhì)體的制備率最高.只用蝸牛酶處理就可以獲得較高數(shù)量的原生質(zhì)體.通過預(yù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算,簡青霉出發(fā)菌株原生質(zhì)體的制備率為16.9%、再生率為90.4%.簡青霉原生質(zhì)體的高再生率,有利于進(jìn)行下一步的紫外誘變.

圖1 簡青霉生長曲線Fig.1 Growth curve of Penicillium simplicissimum

2.3 簡青霉原生質(zhì)體的紫外照射致死曲線

采用紫外線對(duì)簡青霉原生質(zhì)體即出發(fā)菌株原生質(zhì)體進(jìn)行不同時(shí)間的照射,原生質(zhì)體的致死率與誘變時(shí)間的關(guān)系如圖2所示.研究表明,當(dāng)致死率在80%左右時(shí),產(chǎn)生的正誘變菌株較多,但高致死率有利于篩選到產(chǎn)量提高幅度大的誘變菌株[17].本實(shí)驗(yàn)選用紫外照射致死率在 80%～98%的誘變菌株用于初篩,并從紫外照射致死率在85%的處理中成功篩選出誘變菌株 J12,從紫外照射致死率在 97%的處理中獲得誘變菌株 J18.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該紫外照射致死率范圍內(nèi)的誘變效果理想.

圖2 紫外線照射不同時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體致死率影響Fig.2 Effect of UV irradiation time on the death rate of the protoplast

2.4 誘變菌株篩選

依次重復(fù)在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株、挑選誘變菌株和傳代的過程,傳7代后,篩選獲得2株誘變菌株J12和誘變菌株J18,它們?cè)阼b別培養(yǎng)基上的褪色及生長情況均優(yōu)于出發(fā)菌株J.

2.5 誘變菌株與出發(fā)菌株的形態(tài)比較

誘變菌株J18與出發(fā)菌株J相比,發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化.誘變菌株 J12的孢子形態(tài)和菌落形態(tài)及大小與出發(fā)菌株J相同,未發(fā)生變化.

由圖3可見,誘變菌株J18的孢子形態(tài)為圓形,相對(duì)于出發(fā)菌株J的橢圓形孢子而言,形態(tài)學(xué)上發(fā)生了很明顯的變化.

圖3 出發(fā)菌株J孢子與誘變菌株J18孢子光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果Fig.3 The spore morphology of original strain J, mutant strain J18(Seen in light microscope)A.出發(fā)菌株J孢子; B.誘變菌株J18

由圖4可以看出,培養(yǎng)相同時(shí)間后,誘變菌株J18的菌落顏色為深綠色,出發(fā)菌株J的菌落顏色為綠色,并且菌落直徑要大于出發(fā)菌株 J的菌落直徑.說明在相同條件下,誘變菌株J18的生長能力更強(qiáng).

2.6 對(duì)木質(zhì)素降解效果的比較

2.6.1 產(chǎn)木質(zhì)素降解酶分析 從圖5可知,出發(fā)菌株J、誘變菌株J12和誘變菌株J18的最大木質(zhì)素過氧物化物酶酶活都出現(xiàn)在固態(tài)發(fā)酵的第10d.誘變菌株J18產(chǎn)生最大的木質(zhì)素過氧化物酶酶活,為67.1U/g,是出發(fā)菌株J的最大木質(zhì)素過氧化物酶酶活48.0U/g的1.40倍,提高了40%,誘變后酶活提高較顯著.菌株 J12的最大木質(zhì)素過氧化物酶酶活為44.4U/g,略低于出發(fā)菌株J.

圖4 出發(fā)菌株J與誘變菌株J18菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of original strain J and mutant strain J18A.出發(fā)菌株J; B.誘變菌株J18

圖5 原始株和誘變株木質(zhì)素過氧化酶酶活比較Fig.5 The activities of Lip of original strain and mutant strains數(shù)據(jù)為3次測量的平均值

從圖6可知,出發(fā)菌株J和誘變菌株J12的最大漆酶酶活出現(xiàn)在第20d,誘變菌株J18的最大漆酶酶活出現(xiàn)在第25d.誘變菌株J12的最大漆酶酶活為 44.0U/g,是出發(fā)菌株 J的最大漆酶酶活18.0U/g的2.45倍,提高了145%,誘變后酶活提高顯著.誘變菌株 J18的最大漆酶酶活為 20.8U/g,是出發(fā)菌株J的最大酶活17.9U/g的1.16倍,提高了16%.

圖6 原始株和誘變株漆酶酶活比較Fig.6 The activities of laccase of original strain and mutant strains數(shù)據(jù)為3次測量的平均值

圖7 原始株和誘變株錳過氧化物酶酶活比較Fig.7 The activities of Mnp of original strain and mutant strains數(shù)據(jù)為3次測量的平均值

從圖7可知,出發(fā)菌株J的最大錳過氧化物酶酶活出現(xiàn)在第5d,誘變菌株J12和誘變菌株J18的最大錳過氧化物酶酶活都出現(xiàn)在第 15d.從第20d開始,出發(fā)菌株J及誘變菌株J12、J18均檢測不出錳過氧化物酶酶活.誘變菌株 J12的最大錳過氧化物酶酶活為50.8U/g,是出發(fā)菌株J的最大錳過氧化物酶酶活34.6U/g的1.47倍,誘變后錳過氧化物酶酶活提高了 47%,誘變后酶活提高較顯著.誘變菌株 J18的最大錳過氧化物酶酶活是37.3U/g,略高于出發(fā)菌株J.

由表1數(shù)據(jù)可知,經(jīng)過7次傳代,誘變菌株J18產(chǎn)生的最大木質(zhì)素過氧化酶酶活、誘變菌株J12產(chǎn)生的最大錳過氧化物酶酶活和最大漆酶酶活相對(duì)于出發(fā)菌株 J仍然保持有極顯著提高(P＜0.01),誘變菌株J18產(chǎn)生的漆酶酶活相對(duì)于出發(fā)菌株J有顯著提高(P＜0.05),說明誘變菌株J12和誘變菌株 J18的遺傳性狀穩(wěn)定.各菌株的木質(zhì)素過氧化物酶酶活最大值和錳過氧化物酶酶活最大值出現(xiàn)的時(shí)間較接近且較早,而漆酶酶活的最大值出現(xiàn)最晚.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是漆酶對(duì)木質(zhì)素的降解能力要弱于其他 2種木質(zhì)素降解酶,木質(zhì)素經(jīng)過木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶一定程度的降解后,將更易于被漆酶降解,是 3種木質(zhì)素降解酶在降解木質(zhì)素方面協(xié)同作用的表現(xiàn).

表1 出發(fā)菌株與誘變菌株經(jīng)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的最大木質(zhì)素降解酶酶活之間比較Table 1 Compared original strain with mutants in highest ligninolytic enzymes by solid fermentation

2.6.2 木質(zhì)素降解能力的分析及比較 誘變菌株對(duì)木質(zhì)素的實(shí)際降解能力如表 2所示,出發(fā)菌株J、誘變菌株J12和誘變菌株J18的木質(zhì)素降解率,依次為9.94%、16.65%和29.63%.相對(duì)于出發(fā)菌株 J,誘變菌株 J12和誘變菌株J18的木質(zhì)素降解率分別提高了 67.5%和198.1%,有極顯著提高(P＜0.01).中性洗滌的去除物主要是指用中性洗滌劑(pH7)消化植物細(xì)胞后,溶于中性洗滌劑中的細(xì)胞內(nèi)容物,包括蛋白質(zhì)、脂肪和無氮浸出物(糖類、淀粉和果膠)等物質(zhì).中性洗滌去除物是結(jié)構(gòu)簡單的有機(jī)物,在固態(tài)發(fā)酵初期應(yīng)首先被降解,但經(jīng)過 30d的固態(tài)發(fā)酵后,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的中性洗滌去除物含量沒有減少反而增加,可能是復(fù)雜結(jié)構(gòu)的半纖維素、纖維素及木質(zhì)素被分解后所形成的產(chǎn)物.出發(fā)菌株J、誘變菌株J12和誘變菌株J18的中性洗滌去除物提高率,依次為12.85%、 22.48%和 30.80%,有極顯著提高(P＜0.01).相對(duì)于出發(fā)菌株J,誘變菌株J12和誘變菌株J18的中性洗滌去除物提高率分別提高了 74.9%和139.7%,有極顯著提高(P＜0.01).

表2 固態(tài)發(fā)酵前后木質(zhì)纖維素組分質(zhì)量變化Table 2 Quality changes of lignocellulose components before and after solid fermentation

2.7 討論

本實(shí)驗(yàn)所用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中僅加入了水稻秸稈和蒸餾水,未加入任何其它營養(yǎng)物質(zhì)或者對(duì)水稻秸稈進(jìn)行任何形式的預(yù)處理.經(jīng)過 30d的固態(tài)發(fā)酵誘變菌株J12和J18對(duì)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的木質(zhì)素降解率達(dá)到 16.59%和 29.68%.相對(duì)于培養(yǎng)天數(shù)相同,培養(yǎng)條件相似的菌種Phanerochaete chrysosporium、Pleurotus eryngii、Phlebia radiata、Ceriporiosis subvermispora和Ceriporiopsiss subvermispora對(duì)木質(zhì)素的降解率6%～11%[18-19],誘變菌株J12和J18對(duì)木質(zhì)素的降解效果顯著.

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,誘變菌株 J18對(duì)木質(zhì)素降解能力最強(qiáng),這主要是由于誘變菌株 J18分泌的木質(zhì)素過氧化物酶酶活最大.自然界中木質(zhì)素是由非酚結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素單元和酚結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素單元組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酚類聚合物,其中非酚結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素單元大約占木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元的90%[7,20],一般情況下,只有木質(zhì)素過氧化物酶能降解非酚結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素,因此木質(zhì)素過氧化物酶酶活大小對(duì)木質(zhì)素的降解影響極顯著.盡管誘變菌株 J18在漆酶和錳過氧化物酶的提高率上不如誘變菌株 J12,但其對(duì)木質(zhì)素的降解率卻要優(yōu)于誘變菌株 J12.由此可見,本實(shí)驗(yàn)中木質(zhì)素過氧化物酶在對(duì)木質(zhì)素降解中所起的作用要大于其他2種木質(zhì)素降解酶.中性洗滌去除物可以被用于大部分土壤微生物的初級(jí)代謝,因此中性洗滌去除物含量越高,越有利于多種土壤微生物的共生作用和協(xié)同作用.經(jīng)過30d的固態(tài)發(fā)酵,培養(yǎng)誘變菌株 J18的固態(tài)培養(yǎng)基中的中性洗滌去除物增加量是誘變菌株J的2.46倍,有利于土壤中各類微生物利用協(xié)同作用對(duì)土壤中的木質(zhì)纖維素進(jìn)行降解,更易于形成腐殖質(zhì),提高土壤的養(yǎng)分.誘變菌株J12的木質(zhì)素過氧化物酶雖然略低于出發(fā)菌株J,但因其漆酶和錳過氧化物酶的酶活要顯著高于出發(fā)菌株J,因此其對(duì)木質(zhì)素的降解率要明顯高于出發(fā)菌株 J.由此可見,在本實(shí)驗(yàn)中漆酶和錳過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素的降解作用雖然沒有木質(zhì)素過氧化物酶大,但其作用不容忽視.誘變菌株 J12盡管對(duì)木質(zhì)素的降解率差于誘變菌株

J18,但其漆酶產(chǎn)量很高,可用于漆酶產(chǎn)生機(jī)理的研究和木質(zhì)素降解酶之間協(xié)同作用的研究.

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)簡青霉原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變,顯著提高出發(fā)菌株 J的木質(zhì)素降解酶酶活.誘變菌株J12的漆酶酶活提高145%、錳過氧化物酶酶活提高47%.誘變菌株J18的木質(zhì)素過氧化物酶酶活提高40%.

3.2 誘變后的菌株對(duì)木質(zhì)素的降解能力得到了顯著提高.誘變菌株 J18對(duì)木質(zhì)素降解率提高198.1%.誘變菌株 J12對(duì)木質(zhì)素降解率提高67.5%.

3.3 誘變菌株經(jīng)過7次連續(xù)傳代接種,對(duì)木質(zhì)素保持高效的降解率,具有遺傳穩(wěn)定性.

3.4 木質(zhì)素過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素的降解能力大于其他2種木質(zhì)素降解酶,其在木質(zhì)素降解過程中起主要作用的機(jī)理有待作進(jìn)一步的深入研究.

[1] Novaes E, Kirst M, Chiang V, et al. Lignin and biomass: a negative correlation for wood formation and lignin content in trees [J]. Plant Physiol. ,2010,154(2):555-561.

[2] Guang Ming Zeng,Hong Yan Yu et al. Laccase activities of a soil fungus Penicillium simplicissimum in relation to lignin degradation [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006,22(4):317.

[3] 郁紅艷,曾光明,黃國和,等.簡青霉Penicillium simplicissimum木質(zhì)素降解能力 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2005,26(2):167-171.

[4] 郁紅艷,曾光明,黃國和,等.木質(zhì)素降解真菌的篩選及產(chǎn)酶特性[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2004,10(5):639-642.

[5] Gutarra M L, Godoy M G, Maugeri F, et al. Production of an acidic and thermostable lipase of the mesophilic fungus Penicillium simplicissimum by solid-state fermentation [J]. Bioresour. Technol., 2009,100(21):5249-5254.

[6] Liew C Y, Husaini A. Lignin biodegradation and ligninolytic enzyme studies during biopulping of Acacia mangium wood chips by tropical white rot fungi [J]. World J. Microbiol. Biotechnol., 2011,27:1457-1468.

[7] 池玉杰,伊洪偉.木材白腐菌分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)-錳過氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶催化分解木質(zhì)素的機(jī)制 [J]. 菌物學(xué)報(bào), 2007,26(1):153-160.

[8] Archibald F S. A new assay for lignin-type peroxidases employing the dye azure B. [J]. Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58(9):3110-3116.

[9] 劉衛(wèi)曉,鈔亞鵬,錢世鈞.漆酶高產(chǎn)工程菌構(gòu)建及漆酶對(duì) RBBR的脫色作用 [J]. 生物加工過程, 2004,2(1):21-24.

[10] 鈔亞鵬,葉 軍.擔(dān)子菌組成型漆酶產(chǎn)生特性的研究 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2000,40(6):628-632.

[11] 施巧琴,吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué) [M]. 中國: 科學(xué)出版社, 2002:300-303.

[12] Tien M, Kirk T K. Lignin Peroxidase of Phanerochaete chrysosporium [J]. Methods In Enzymology, 1988,161:238-249.

[13] Datta A, Bettermann A, Kirk T K. Identification of a specific manganese peroxidase among ligninolytic enzymes secreted by Phanerochaete chrysosporium during wood decay [J]. Appl. Environ. Microbiol., 1991,57(5):1453-1460.

[14] Buswell J A, Cai Y, Chang S. Effect of nutrient nitrogen and manganese on manganese peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes [J]. FEMS Microbiology Letters, 1995,128(1):81-87.

[15] Van Soest P J. Use of detergents in the analysis of fibrous feeds.A rapid method for determination of fiber and lignin [J]. J. Assn.Official Agr. Chem., 1963,46:829.

[16] Van Soest P J. Use of detergents in the analysis of fibrous feeds. Determination of plant cell-wall constituents [J]. J.Assn.Official Agr.chem., 1967,50:50.

[17] 馮 栩,李旭東,曾抗美,等.紫外線誘變提高特效菌的降解性能[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2008,28(9):807-812.

[18] Jose D, Gonzalo A, Susana C. Transformation of wheat straw in the course of solid-state fermentation by four ligninolytic basidiomycetes [J]. Enzyme And Microbial Technology, 1999, 25(7):605-612.

[19] Guerra A, Mendonca R, Ferraz A, et al. Structural characterization of lignin during Pinus taeda wood treatment with Ceriporiopsis subvermispora [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70(7):4073-4078.

[20] Tuor U, Wariishi H, Schoemaker H E, Gold M H. Oxidation of phenolic arylglycerol β-aryl ether lignin model compounds by manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium: oxidative cleavage of an α-carbonyl model compound [J]. Biochemistry, 1992,31:4986-4995.

Improving lignin degradation ability of Penicillium simplicissimum by UV induced protoplast mutagenesis.

SHEN Ying1,2, HU Tian-jue1,2*, ZENG Guang-ming1,2, WU Juan-juan1,2, HUANG Chao1,2, LIU Hui1,2, HUANG Dan-lian1,2, YIN Lu1,2(1.College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China；2.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control, Ministry of Education, Hunan University, Changsha 410082, China). China Environmental Science, 2012,32(3)：485～491

The aim of this study was to obtain new Penicillium simplicissimum mutants with high yield of ligninolytic enzymes. UV induced mutagenesis of protoplast was performed on original strain Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BGA. Two genetically stable mutant strains J12 and J18 were selected from a large amount of the regenerative mutants. The highest laccase and manganese peroxidase (Mnp) activities produced by strain J12 were 1.45 and 0.47-fold higher than that by original strain, reached 44.0 U/g and 50. 9 U/g, respectively. The highest lignin peroxidase (LiP) activity of 67.1 U/g was obtained by strain J18, which was 0.4-fold increased compared with its original strain. The highest degradation rate of lignin also was obtained by strain J18, which increased 1.98-fold compared with its original strain. Further experiment confirmed after seven generations successively propagating the activity of strain J12 and strain J18 were stable and did not decrease generally.

Penicillium simplicissimum；mutagenesis；biodegradation；lignin

X705

A

1000-6923(2012)03-0485-07

2011-06-22

湖南省自然科學(xué)基金(07JJ5053);湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金項(xiàng)目(11K013);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)

* 責(zé)任作者, 副教授, hutj66@yahoo.com.cn

沈 瑩(1982-),女,遼寧鞍山人,湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生,主要研究方向?yàn)槲⑸飳?duì)有機(jī)固體廢物的降解.發(fā)表論文2篇.