趙 玫(綜述)，吳海珍(審校)

(安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院暨105醫(yī)院口腔中心，合肥230032)

近年來，骨組織工程的研究工作主要集中在種子細(xì)胞、支架材料、成骨因子和骨的構(gòu)建幾個(gè)方面。隨著骨組織工程支架材料的深入研究，納米級(jí)羥基磷灰石(nanograde hydroxyapatite，nHAP)作為一種生物陶瓷類材料，以其優(yōu)良的生物學(xué)性能受到廣泛的關(guān)注，尤其是納米羥基磷灰石復(fù)合材料，及其與骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建工程化骨取得了較大進(jìn)展。

1 羥基磷灰石與nHAP

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是人體和動(dòng)物骨骼、牙齒的主要無機(jī)成分，具有良好的生物相容性、生物活性、骨傳導(dǎo)性，被認(rèn)為是一種最具潛力的人體硬組織替換材料。人體內(nèi)天然HAP為65～80 nm的針狀結(jié)晶體，其粒徑位于納米范圍，因此，nHAP與人體的無機(jī)成分更加相似，具有更佳的生物性能［1］。

研究表明，nHAP材料可以:①促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附［2］。Thian 等［3］用水電動(dòng)力噴霧法制得 nHAP，體外研究發(fā)現(xiàn)，人成骨細(xì)胞在此nHAP材料表面生長(zhǎng)速率明顯提高。②促進(jìn)成骨細(xì)胞功能代謝［2］。由于材料表面成骨細(xì)胞的聚集和轉(zhuǎn)化因子濃度的提高，促進(jìn)了成骨細(xì)胞增殖、礦化，最終植入材料與周圍組織進(jìn)行了有效的骨整合。Abd El-Fattah等［4］將nHAP實(shí)驗(yàn)組與 HAP組作對(duì)照，nHAP實(shí)驗(yàn)組顯示出更好的成骨能力。

2 nHAP復(fù)合支架材料

盡管nHAP作為醫(yī)用生物材料優(yōu)勢(shì)明顯，但仍存在脆性大、骨誘導(dǎo)活性差、強(qiáng)度低、力學(xué)性能相對(duì)較差的問題。為了克服這些弊端，許多學(xué)者進(jìn)行了nHAP復(fù)合支架材料研究［5］。nHAP復(fù)合材料指在nHAP中加入第二相或者多相材料，進(jìn)而可以獲得更好的組織學(xué)反應(yīng)、滿意的強(qiáng)度，成為組織再生工程的支架材料。

2.1 膠原 膠原是骨組織的主要成分之一，優(yōu)點(diǎn)有以下幾方面:①來源豐富，它廣泛存在于人和脊椎動(dòng)物的結(jié)締組織，如皮膚、肌腱、骨和軟骨中。②良好的生物相容性，是人組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，被普遍認(rèn)為最不易引起炎癥和抗原反應(yīng)。③有適合細(xì)胞生長(zhǎng)的孔徑。但由于膠原也有性能不穩(wěn)定，降解速度難以控制等缺點(diǎn)，所以膠原-nHAP復(fù)合材料是目前生物材料研究的熱點(diǎn)。Fukui等［6］將 nHAP-膠原復(fù)合材料植入兔下頜骨缺損處，觀察發(fā)現(xiàn)在該復(fù)合材料上新骨形成量較大。由于膠原分子結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性和大量親水基團(tuán)的存在，使之具有高度的黏附性和親水性，從而在細(xì)胞遷移時(shí)能支持和潤(rùn)滑，還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子(如血小板生長(zhǎng)因子和纖維蛋白等)，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有趨化作用。

2.2 殼聚糖 殼聚糖是自然界中少見的一種帶正電荷的氨基多糖，它的化學(xué)名稱為(1-4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖［7］。殼聚糖具有良好的生物降解性和生物相容性，而且無毒、無刺激性殼聚糖和nHAP結(jié)合可以提高細(xì)胞黏結(jié)、分化及具有良好的形態(tài)。nHAP/殼聚糖重量之比為70∶30時(shí)可以表現(xiàn)出最大的抗壓強(qiáng)度，大約為120 MPa，足以用作承重骨組織的修復(fù)。殼聚糖具有良好的生物降解特性，當(dāng)其作為組織工程支架植入體內(nèi)后，殼聚糖的降解為新骨的生長(zhǎng)提供足夠的空間，直至完全被新骨替代，所以nHAP/殼聚糖復(fù)合材料植入體內(nèi)后將可以有效地促進(jìn)骨的修復(fù)和重建。在但殼聚糖只能溶于酸性環(huán)境，使得其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用受到了限制。羧甲基殼聚糖是殼聚糖分子羧甲基化得到的一種水溶性產(chǎn)物，具備殼聚糖所有優(yōu)質(zhì)性質(zhì)，且更利于與其他物質(zhì)結(jié)合，在體內(nèi)可以完全降解。王海斌等［8］采用化學(xué)沉淀法合成了nHAP粉體，通過粒子瀝濾法制備羧甲基殼聚糖/nHAP多孔復(fù)合材料，測(cè)定其材料的孔隙率接近75%，抗壓強(qiáng)度可達(dá)21 MPa以上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植入兔骨缺損處未見引起骨組織明顯的炎性反應(yīng)及骨壞死，肝腎功能檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)有肝腎毒性，提示該支架材料具有良好的組織相容性和生物安全性。

2.3 聚乳酸和聚酰胺 人工合成的有機(jī)物與nHAP復(fù)合，可以明顯提高nHAP的力學(xué)強(qiáng)度和韌性。聚乳酸種類多種多樣，通常認(rèn)為聚乳酸對(duì)復(fù)合材料的影響主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量的大小，相對(duì)分子質(zhì)量越大，復(fù)合材料的力學(xué)性能越好［9］，也有研究者認(rèn)為，隨著nHAP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，nHAP團(tuán)聚現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，造成復(fù)合支架彎曲模量，壓縮模量出現(xiàn)先增后減的現(xiàn)象［10］。有文獻(xiàn)證明［11］，nHAP 微粒的分散性對(duì)復(fù)合材料的強(qiáng)度有很大的影響，分散性越好，強(qiáng)度越高。但是聚乳酸與nHAP這兩種材料的性質(zhì)相去甚遠(yuǎn)，相容性較差，形成的復(fù)合材料界面不穩(wěn)，在熱加工后冷卻時(shí)容易在兩相界面間產(chǎn)生裂紋，可以導(dǎo)致力學(xué)性能降低［12］，所以目前通常采用耦聯(lián)劑來對(duì)nHAP粒子表面進(jìn)行改性，使得耦聯(lián)劑親水端與nHAP產(chǎn)生作用。

由于聚酰胺分子鏈上含有酰胺鍵，與蛋白骨架結(jié)構(gòu)類似，同時(shí)也有很好的力學(xué)強(qiáng)度，優(yōu)良的韌性，其剛度也超過了相同分子量的聚乳酸及聚乙烯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，nHAP/聚酰胺復(fù)合材料具有優(yōu)異的生物活性和力學(xué)性能，與自然骨能形成牢固的生物性的骨鍵合［13］。另外，還發(fā)現(xiàn)該種材料具有誘導(dǎo)軟骨的特性。Xu等［14］合成的三維多孔nHAP/PA66支架，實(shí)驗(yàn)測(cè)試該支架具有顯著的組織相容性和骨誘導(dǎo)性，被認(rèn)為是有潛力的骨替代材料。

2.4 多相復(fù)合物 目前對(duì)nHAP支架材料的研究熱點(diǎn)不僅僅局限于單純與天然或者人工合成材料二相復(fù)合，而在改性的三相和多相的復(fù)合支架研究方面業(yè)已引起人們的重視。Niu等［15］在制備殼聚糖微球和羥基磷灰石膠原(nanohydr-oyapatita/collagen，nHAC)的基礎(chǔ)上，又加入聚乳酸合成出殼聚糖微球/nHAC/P-LLA，實(shí)驗(yàn)中以nHAC/聚乳酸為對(duì)照組來修復(fù)兔股骨6 mm的缺損。體外測(cè)試表明，實(shí)驗(yàn)組有更好的形態(tài)和骨增殖能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在4、8、12周形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察，實(shí)驗(yàn)組更好地加速了松質(zhì)骨缺損再生的能力。Huang等［16］用殼聚糖來改性nHAP/PA66，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該改性支架材料的壓縮模量和壓縮強(qiáng)度都較對(duì)照組增強(qiáng)了5～6倍。

3 nHAP支架材料與骨形成蛋白

骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一種存在于骨基質(zhì)中的二聚物分子，為一種疏水性酸蛋白，其主要的生物學(xué)作用是誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化形成軟骨和骨，其作用沒有種屬特異性，具有跨種誘導(dǎo)成骨的性能。此外，BMP還具有刺激新生血管形成的能力［17］。在BMP家族中，BMP-2的骨誘導(dǎo)活性強(qiáng)，是研究較多的骨組織工程中的骨生長(zhǎng)因子。BMP單獨(dú)使用半衰期很短，在體內(nèi)擴(kuò)散很快，易被中性蛋白酶分解，因而不能在有效的時(shí)間內(nèi)作用于更多的靶細(xì)胞，其活性難以得到充分發(fā)揮，而且由于缺乏骨細(xì)胞生長(zhǎng)所需的三維空間結(jié)構(gòu)，新骨生成量少。當(dāng)nHAP和BMP-2與適當(dāng)?shù)妮d體復(fù)合后能阻止BMP-2的迅速降解，使其在骨修復(fù)中持續(xù)發(fā)揮誘導(dǎo)作用，成骨效果可以放大許多倍。Iton等［18］通過放射學(xué)和組織學(xué)觀察后顯示，nHAP-膠原復(fù)合材料吸附重組人 BMP2(recombinant human BMP2，rhBMP2)后可刺激動(dòng)物脛骨缺損處的新骨形成，可誘導(dǎo)骨重建。Liu 等［19］以5∶1(v/w)的比例將膠原和nHAP 合成，再和膠原纖維蛋白、rhBMP2采用凍干技術(shù)合成了rhBMP2/明膠/nHAP/纖維蛋白的支架材料。免疫組化顯示，rhBMP2的釋放可以提高骨鈣素堿性磷酸酶的表達(dá)和鈣沉積的形成，且支架無毒性。通過大體標(biāo)本和X線，及骨組織形態(tài)學(xué)和骨密度檢測(cè)均顯示良好的成骨能力，12周后可完全修復(fù)節(jié)段性兔骨缺損。

4 nHAP支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因自身獨(dú)特優(yōu)勢(shì)成為骨組織工程中理想的種子細(xì)胞。已有研究表明［20-21］，BMSCs在支架材料內(nèi)黏附生長(zhǎng)、增殖分化，分泌出含有骨源性生長(zhǎng)因子(BMP、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等)的基質(zhì)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞或者軟骨細(xì)胞分化，以促進(jìn)更多的新骨在支架材料周圍和內(nèi)部形成，從而實(shí)現(xiàn)組織工程化骨。以BMSCs作為目標(biāo)細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)，成為研究熱點(diǎn)。張凱等［22］采用 nHA 的孔徑為100～250 μm，孔隙率為90%，直徑和厚度為5 mm的圓片狀支架材料，觀察兔BMSCs與支架材料的生物相容性。復(fù)合培養(yǎng)3 d后堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，5 d后細(xì)胞數(shù)目明顯增加，說明nHAP具有良好的組織相容性，同時(shí)材料孔隙及其表面物質(zhì)為BMSCs的黏附增殖分化提供了非常有利的條件。Phipps等［23］證實(shí)，BMSCs在聚己酸內(nèi)酯/膠原/nHAP三維支架材料中黏附增殖能力強(qiáng)，并且對(duì)該材料進(jìn)行了力學(xué)實(shí)驗(yàn)，表明它具有良好的力學(xué)性能。實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為該支架材料的這些優(yōu)點(diǎn)，是因?yàn)槠渫瑫r(shí)具備了聚己酸內(nèi)酯的機(jī)械性能和膠原、HAP的天然生化性能。戚孟春等［24］用密度梯度離心法分離出兔BMSCs，與制備好的nHA/PA66支架材料復(fù)合培養(yǎng)，將單獨(dú)BMSCs和加入了骨相誘導(dǎo)液的組作為對(duì)照，掃描電鏡觀察下表明支架材料適合于細(xì)胞附著，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛細(xì)胞間有廣泛的細(xì)胞突起連接。研究證實(shí)，nHA/PA66適于BMSCs黏附生長(zhǎng)及骨向分化，是一種性能優(yōu)良的骨組織工程支架材料，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

5 骨組織工程nHAP材料的生物學(xué)評(píng)價(jià)

隨著納米材料在骨缺損中應(yīng)用越來越廣泛，納米材料的毒性效應(yīng)也日益受到人們的高度關(guān)注。納米材料的尺寸很微小，當(dāng)小顆粒尺寸進(jìn)入納米級(jí)時(shí)，其特性與大塊材料有明顯的區(qū)別，一些原本無毒或者具有輕微毒性的顆粒達(dá)到納米級(jí)時(shí)毒性明顯增強(qiáng)。對(duì)于植入性生物材料，因其會(huì)在體內(nèi)存留時(shí)間較長(zhǎng)，所以材料的安全性如何，是否對(duì)人體有危害，是值得嚴(yán)肅關(guān)注的問題。一種醫(yī)用材料在植入生物體或者臨床應(yīng)用之前，必須按照國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。

參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)發(fā)布的醫(yī)療器械和生物材料生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南ISO10993(GB/T16886)和我國(guó)衛(wèi)生部制定的生物材料和醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1997，制定了從細(xì)胞水平到整體動(dòng)物的較完整的評(píng)價(jià)框架，采用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、致敏實(shí)驗(yàn)、急性毒性實(shí)驗(yàn)、熱原實(shí)驗(yàn)以及遺傳毒性實(shí)驗(yàn)來初步評(píng)價(jià)nHAP復(fù)合材料的生物安全性，從而為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

研究nHAP材料對(duì)細(xì)胞毒性作用，第一步要解決的問題是明確該材料對(duì)細(xì)胞的作用。最常用的一類方法是通過細(xì)胞存活率判斷細(xì)胞毒性大小，其中3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法(MTT)是目前納米材料細(xì)胞毒性檢測(cè)中最常用的方法。代震宇等［25］將 nHAP/聚氨基酸復(fù)合材料按照ISO10993-1標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)觀察材料對(duì)細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)無明顯影響，MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞毒性為1級(jí)，全身急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物無中毒及死亡，致敏實(shí)驗(yàn)顯示無水腫及紅斑，溶血實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為該材料具有良好生物安全性。李鴻等［26］用注塑方法，以nHAP/PA66復(fù)合材料為原料，使用專用的發(fā)泡劑，制備出了一種平均孔隙尺寸為500 μm、孔隙率為75%的多孔支架，并對(duì)其進(jìn)行了生物安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該材料具有良好的生物安全性，可用于骨組織修復(fù)。湯京龍等［27］在對(duì)nHAP做急性毒性實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，nHAP在存在一定的團(tuán)聚的情況下，容易引起血管栓塞導(dǎo)致動(dòng)物死亡，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明充分分散的nHAP在進(jìn)入血液循環(huán)后有可能潛移到體內(nèi)其他器官中。

由于nHAP復(fù)合材料本身在骨缺損修復(fù)中的優(yōu)越性，使得針對(duì)此類材料的研究更加完善，并且可以作為BMSc和BMP-2的載體材料?？墒且廊淮嬖诤芏鄦栴}需要繼續(xù)研究解決，比如，如何改善合成方法來提高材料的強(qiáng)度性能，如何進(jìn)一步完善和測(cè)定此類材料的生物安全性等。當(dāng)然，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)nHAP復(fù)合材料的研究都主要集中在實(shí)驗(yàn)室階段，與臨床使用還具有很大的距離。因此，nHAP的發(fā)展與應(yīng)用在具有良好前景的同時(shí)也面臨諸多挑戰(zhàn)。

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