黃柯鑫 綜 述 趙 斌 審 校

廣東醫(yī)學院神經(jīng)病學，廣東省湛江市 524000

20世紀80年代，F(xiàn)elgner等首次通過實驗證明了陽離子脂質體可用于DNA轉染。近年來，基因轉染技術在生物學研究領域和臨床應用都已取得了很大的進展。陽離子脂質體安全性好、操作簡單，被廣泛用于DNA、RNA的細胞轉染。陽離子脂質體在基因轉染的成功運用，為基因轉移開辟了一條新途徑，并顯示出廣闊的前景。然而，陽離子脂質體參與體內外基因轉染的過程中，受到諸多因素的影響，現(xiàn)就其進展綜述如下。

1 脂質體介導的基因轉移機制

陽離子脂質體介導的基因轉染主要通過胞吞作用進入細胞內，其機制可簡述為：帶正電的陽離子脂質體通過靜電作用與帶負電的基因（DNA或RNA）形成脂質－基因復合物（lipoplexes，簡稱脂質復合物），陽離子脂質體表面過剩的正電荷通過靜電作用吸附于帶負電的細胞膜上［1］，而脂質體本身具有的親脂性，使脂質復合物通過細胞內吞或細胞膜融合作用進入細胞內形成內涵體；脂質復合物在細胞質中或進一步傳遞到細胞核內釋放基因，從而在細胞內轉錄和翻譯。

2 影響陽離子脂質體轉染效率的因素

2.1 陽離子脂質體的構型 深入探究陽離子脂質體的構效關系，對提高其轉染效率有著重要的意義［2］。陽離子脂質體通常由一個陽離子兩性化合物即細胞轉染素（cytofectin）和一個中性（或兼性）輔助磷脂組成。常用的輔助磷脂有二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1，2二油酸甘油3磷脂酰膽堿（DOPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、膽固醇（Chol）、磷脂酰膽堿（PC）等。細胞轉染素與輔助磷脂結合能形成穩(wěn)定的雙層膜結構，降低陽離子頭部的毒性作用，同時為陽性脂質提供細胞滲透功能，因此，中性輔助脂成分可增強陽離子脂質體的轉染活力［3］。其中，中性磷脂DOPE的細胞膜去穩(wěn)定化作用，能直接誘導脂質體膜與內涵體膜融合，從而使DNA迅速釋放。研究發(fā)現(xiàn)，陽離子脂質單體有錐形、非反轉六角形（HⅠphase）和反轉六角形（HⅡphase）等不同空間構型，當膜融合作用占優(yōu)勢時 HⅡphase的結構形式最利于轉染［4］。

2.2 陽離子脂質體的制備 除了陽離子脂質體本身的構型特點外，脂質體的制備差異，對脂質體/DNA復合物的結構和穩(wěn)定性也起到重要的影響，進而影響轉染效率。在體內轉染中，陽離子脂質體從溶酶體釋放進入細胞質的速率，對轉染效果有著直接的影響。在陽離子脂質和中性輔助磷脂這兩種成分的基礎上，添加其他的輔助材料，也可提高脂質體的轉染效率。Shigeta等［5］合成了新型的組氨酸－半乳糖化膽固醇衍生物Gal2His2C42Chol（2），具有“質子海綿效應”，能加速陽離子脂質體從溶酶體釋放、進入細胞質的過程，從而使細胞的轉染效率明顯提高。此外，有研究者運用某些輔助成分如多肽、多聚物等，利用其滲透作用或去垢劑類似作用機制使溶酶體破裂，轉染效率也可明顯提高 。

2.3 DNA的大小及構型 研究表明質粒DNA的大小 對 轉 染 效 率 有 很 大 影 響［6］。Katrien 等［7］以DOTAP/DOPE陽性脂質體為基因載體，將3種構型（超螺旋、開環(huán)和線型）的質粒DNA分別轉染Vero細胞，結果發(fā)現(xiàn)超螺旋質粒DNA的轉染效率最高。Lukacs等［8］通過對Hela細胞的實驗發(fā)現(xiàn)小于100bp的DNA片段可以在細胞的細胞質中自由移動。而隨著DNA片段的增大，其在細胞質中的遷移能力也隨之降低。這是由于核孔對于進入細胞核的DNA具有“尺寸限制功能”。此外，小分子DNA更容易與帶負電荷的物質相互競爭交換而從LPP中解離出來。

2.4 脂質體/DNA復合物的正負電荷比例 脂質體/DNA復合體中兩者的正負電荷比例是影響基因轉染效率的重要因素。其中的一個重要原因是，兩者所帶電荷比例可直接影響復合體的粒徑；而當lipoplexes的直徑尺寸在0.4～1.4μm 范圍內時，具有更高的 轉 染 效 率［9，10］。Almofti等［11］通 過 電 鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，當脂質體/DNA復合體的電荷比值為1時粒徑最大，認為電荷比值為1時，脂質體與DNA靜電斥力消失，易于集聚，大于或小于1時，產(chǎn)生靜電排斥作用使脂質體DNA均勻分散。實驗證明，脂質體與DNA的電荷比在1∶1時，形成的復合體的粒徑最大，在體內的半衰期延長，基因轉染效率最高［12，13］。另外，帶有稍微過剩陽離子的lipoplexes，其轉染效率更高［14］。

2.5 脂質體/DNA復合體的大小 陽離子脂質體帶正電荷，核酸大分子帶負電。當兩者混合時，可在瞬間發(fā)生相互作用而形成脂質體/DNA復合體——lipoplexes［15］。lipoplexes的大小和形狀受陽離子脂質體和DNA的摩爾比影響，且呈動態(tài)變化。當正負電荷比例接近1時，則有明顯的大小及結構的改變［16］。Rejman等［17］2004在研究復合體的粒徑對細胞內吞作用的影響時發(fā)現(xiàn)，粒徑在200nm～1μm之間的粒子，其通過細胞膜內陷作用進入細胞的過程比較緩慢，使得DNA在到達溶酶體之前就從核內體中釋放出來，避免其在溶酶體內降解。而粒徑小于200nm的復合體在進入細胞后，迅速被轉運至溶酶體內并發(fā)生降解。

2.6 生物學因素 當轉染應用于體內細胞時，受諸多生物學因素的干擾，例如DNA核酸酶對核酸的降解，體內吞噬細胞活化后對DNA的清除作用以及血漿中帶電荷成分對陽離子的影響等。

2.6.1 細胞外干擾因素。在血清環(huán)境中脂質體/DNA復合物的轉染效率較低，其中一個重要原因是血清蛋白中和了脂質體/DNA復合物表面的正電荷，使其與帶負電的細胞表面的靜電作用受到影響。另外，血液中小分子脂類和大分子苷類可破壞復合物的結構，從而降低其轉染效率。Xu等［18］通過實驗觀察推測，血清和血漿成分可能使脂質體/DNA復合物過早地發(fā)生聚集、結構改變與分解。針對此現(xiàn)象，有研究者用聚乙二醇等作為修飾成分，屏蔽陽離子脂質體表面過多的正電荷，從而抑制復合體的聚集 ，同時可阻止lipoplexes與帶負電的血清蛋白相互作用［19］使復合體逃避巨噬細胞的清除。

2.6.2 細胞內干擾因素。目前普遍認為抑制DNA從核內體中釋放的因素以及DNA進入細胞核的干擾因素，均對陽性脂質體介導基因轉染產(chǎn)生重要影響。細胞在有絲分裂時，外源性DNA更容易被細胞核攝取［20］。由此認為，DNA進入細胞核的一個主要機制是依賴于細胞分裂時的有絲分裂被動進入胞核。但對神經(jīng)元細胞的成功轉染提示DNA也可以通過主動運輸穿過核膜。然而，在非有絲分裂的細胞中，粒徑比核孔大的DNA穿過核孔的機制還尚未清楚［20］。此外，脂質體的轉染效率還跟轉染時間、轉染細胞的類型、轉染細胞的生長狀態(tài)及融合程度等因素有關。

3 前景展望

在一系列非病毒載體中，陽離子脂質體介導的基因傳遞系統(tǒng)是最有前景的傳遞系統(tǒng)之一。目前研究者發(fā)現(xiàn)針對不同的靶細胞尋找高特異性的靶向性配體具有廣闊的前景［21］。例如，利用不同性能的分子材料，如親水性陽離子聚合物、表面活性劑、糖蛋白和多糖等對脂質體表面進行修飾，可在生物體內的某個過程起到調控作用，從而提高轉染效率。

脂質－復合物進入細胞膜的調節(jié)機制是基因轉染過程一個重要的限速步驟，如果能從信號分子以及具體作用機制的角度，詳細闡明影響轉染效率的因素，將有利于進一步提高脂質體的轉染效率。

隨著分子生物學和生物化學的不斷發(fā)展，陽離子脂質體轉染基因機制的研究將不斷深入，轉染過程中的影響因素也不斷得到闡明，從而為提高轉染效率提供重要的理論指導。

［1］Tresset G.The multiple faces of self－assembled lipidic systems〔J〕.PMC Biophysics，2009，2（1）：3.

［2］Kumar M，Jinturkar K，Yadav MR，et al.Gemini amphiphiles：a novel class of nonviral gene delivery vectors〔J〕.Crit Rev T－h(huán)er Drug Carrier Syst，2010，27（3）：237－278.

［3］Wasungu L，Hoekstra D.Cationiclipids，lipoplexes and intracellular delivery of genes〔J〕.J Control Release，2006，116（2）：255－264.

［4］Ma B，Zhang S，Jiang H，et al.Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery〔J〕.J Control Release，2007，123（3）：184－194.

［5］Shigeta K，Kawakami S，Higuchi Y，et al.Novel histidine－conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte－selective gene transfer in human hepatoma HepG2cells〔J〕.J Controll Release，2007，118（2）：262－270.

［6］Madeira C，Loura LM，Prieto M，et al.Liposome complexation efficiency monitored by FRET：effect of charge ratio，helper lipid and plasmid size〔J〕.Eur Biophys J，2007，36（6）：609－620.

［7］Katrien R，Nike NS，et al.Influence of plasmid DNA topology on the transfection properties of DOTAP/DOPE lipoplexes〔J〕.J Control Release，2006，115（3）：335－343.

［8］Lukacs GL，Haggie P，Seksek O，et al.Size－dependent DNA Mobility in Cytoplasm and Nucleus〔J〕.J Biol Chem，2000，275（3）：1625－1629.

［9］Van der Aa MA，Koning GA，d’Oliveira C，et al.An NLS peptide covalently linked to linear DNA does not enhance transfection efficiency of cationic polymer based gene de－livery systems〔J〕.J Gene Med，2005，7（2）：208－217.

［10］Esposito C，Generosi J，Mossa G，et al.The analysis of serum effects on structure，size and toxicity of DDAB－DOPE and DCChol－DOPE lipoplexes contributes to explain their different transfection efficiency〔J〕.Colloids Surf B Biointerfaces，2006，53（2）：187－192.

［11］Almofti MR，Harashima H，Shinohara Y，et al.Cationic liposome－mediated gene delivery：biophysical study and mechanism of internalization〔J〕.Arch Biochem Biophys，2003，410（2）：246－253.

［12］Majeti BK，Karmali PP，et al.In vitro gene transfer efficacies of N，N－dialkylpyrrolidinium chlorides：a structure－activity investigation〔J〕.J Med Chem，2005，48（11）：3784－3795.

［13］Fenske DB，Cullis PR.Entrapment of small molecules and nucleic acid－based drugs in liposomes〔J〕.MethodsEnzymol，2005，391：7－40.

［14］Farago O，Gronbech－Jensen N.Simulation of self－assembly of ocationic lipids and DNA into structured complexes〔J〕.J Am Chem Soc，2009，131（8）：2875－2881.

［15］Resina S，Prevot P，Thierry AR.Physico－chemical characteristics of lipoplexes influence cell uptake mechanisms and transfection efficacy〔J〕.PLoS One，2009，4（6）：e6058.

［16］Yang Y，Zhang Z，Chen L，et al.Effect of multifold charge groups and imidazole－4－carboxaldehyde on physicochemical characteristics and transfection of cationic polyphosphazenes/DNA complexes〔J〕.Int J Pharm，2010，390（2）：191－197.

［17］Rejman J，Oberle V，Zuhorn IS，et al.Size－dependent internalization of particles via the pathways of clathrin and caeolaemediated endocytosis〔J〕.Biochem J，2004，377（1）：159－169.

［18］Xu L，Anchordoquy TJ.Cholesterol domains in cationic lipid/DNA complexes improve transfect ion〔J〕.Biochim Biophys Acta，2008，1778（10）：2177－2181.

［19］Ramezani M，Khoshhamdam M，Dehshahri A，et al.The influence of size，lipid composition and bilayer fluidity of cationic liposomes on the transfection efficiency of nano－lipoplexes〔J〕.Colloids Surf B Biointerfaces，2009，72（1）：1－5.

［20］Araujo NM，Vianna CO，Moraes MT，et al.Expression of Hepatitis B virus surface antigen（HBsAg）from genotypes A，D and F and influence of amino acid variations related or not to genotypes on HBsAg detection〔J〕.Braz J Infect Dis，2009，13（4）：266－271.

［21］Mukthavaram R，Marepally S，Venkata MY，et al.Cationic glycolipids with cyclic and open galactose head groups for the selective targeting of genes to mouse liver〔J〕.Biomaterials，2009，30（12）：2369－2384.