劉 洋，陳美霓

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000)

漸逝場熒光顯微術(shù)(evanescent field fluorescence microscopy)是近十年多來新發(fā)展起來的一種顯微鏡技術(shù)。這種技術(shù)利用入射光發(fā)生全內(nèi)反射(total internal reflection)時所產(chǎn)生的漸逝場(evanescent field)的能量來激發(fā)熒光物質(zhì)，因漸逝場的穿透深度極有限，一般僅能激發(fā)界面附近100 nm左右的薄層區(qū)域，熒光信號不受深層熒光分子的干擾，圖像信噪比和靈敏度均得到極大程度的提高，因而使得觀察對象非常清晰，明顯地優(yōu)于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)［1-4］。漸逝場熒光顯微術(shù)可對活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時的動態(tài)觀測，比如觀察出胞作用和入胞作用現(xiàn)象，亦可對單個分子進(jìn)行成像［5-9］。本文對漸逝場熒光顯微術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用做一介紹。

1 漸逝場熒光顯微術(shù)的物理學(xué)基礎(chǔ)

全內(nèi)反射是一種普遍存在的光學(xué)現(xiàn)象，當(dāng)一束光線從一種高密度介質(zhì)(如玻璃)進(jìn)入一種低密度介質(zhì)(如水溶液或組織、細(xì)胞等)中時，在兩種介質(zhì)的界面處，入射光有一部分發(fā)生反射，另一部分則透射進(jìn)入第二種介質(zhì)內(nèi)，入射角和透射角之間滿足關(guān)系式 n1sinθ1=n2sinθ2，其中 n1和 n2分別代表兩種介質(zhì)的折射率。當(dāng)入射角增大到等于或大于臨界角(θc=arcsin(n2/n1))時，不再有光線透射進(jìn)入第二種介質(zhì)，即所有的光線都發(fā)生了反射，這一現(xiàn)象被稱為全內(nèi)反射。盡管從幾何光學(xué)的理論來講，當(dāng)發(fā)生全反射時，所有光線都在兩種介質(zhì)的界面上發(fā)生反射而不進(jìn)入第二種介質(zhì)中，但實(shí)際上由于波動效應(yīng)，有一部分光的能量會穿過界面穿透到第二種介質(zhì)中去，向界面下傳播，這種光場被稱為漸逝場，亦稱為漸逝波(evanescent wave)［10］。漸逝場或漸逝波的強(qiáng)度呈指數(shù)衰減，其擴(kuò)散的深度通常只有幾十至幾百nm，因此，當(dāng)觀察細(xì)胞時，幾乎完全排除了細(xì)胞自體產(chǎn)生的自發(fā)熒光的干擾。當(dāng)熒光物質(zhì)趨近玻片時，熒光亮度逐漸增加;當(dāng)熒光物質(zhì)移行離開玻片時，熒光亮度逐漸減弱［11］。

2 漸逝場熒光顯微鏡的類型

漸逝場熒光顯微術(shù)可用兩種方法實(shí)現(xiàn)，一種是基于棱鏡，另一種基于物鏡［1-4，10］。棱鏡模式的漸逝場熒光顯微術(shù)是在含有細(xì)胞樣品的低折射率介質(zhì)(如PBS溶液)上放置一個高折射率的棱鏡。通過調(diào)節(jié)光學(xué)轉(zhuǎn)移平臺和反射鏡的角度可以調(diào)節(jié)激光通過棱鏡照射到含細(xì)胞的溶液上的角度，發(fā)生全內(nèi)反射現(xiàn)象。物鏡模式的漸逝場熒光顯微術(shù)需使用高數(shù)值孔徑的油鏡，可通過調(diào)節(jié)入射光纖和激光的入射角度，從而將熒光的激發(fā)方式從寬場激發(fā)轉(zhuǎn)換為物鏡模式的全內(nèi)反射激發(fā)。其過程如下:①入射激光在物鏡的后聚焦平面中心匯聚，然后通過前透鏡垂直入射進(jìn)入蓋玻片和細(xì)胞上，均一的照亮整個細(xì)胞，完成寬場熒光激發(fā)。②通過千分尺精密調(diào)節(jié)光纖的入射位置，使入射激光匯聚點(diǎn)偏離物鏡后焦平面中心，從而通過物鏡的前透鏡以一個傾斜的角度照射到細(xì)胞上。③進(jìn)一步調(diào)節(jié)入射激光焦點(diǎn)偏離物鏡后焦平面中心的程度，使激光進(jìn)入蓋玻片細(xì)胞的角度增大。④當(dāng)調(diào)節(jié)激光進(jìn)入蓋玻片細(xì)胞的角度增大到一定程度后，所有入射光都被反射回來，在細(xì)胞表面形成消散場。

3 棱鏡和物鏡模式漸逝場熒光顯微術(shù)的比較

漸逝場熒光顯微術(shù)的棱鏡模式和物鏡模式各有其優(yōu)缺點(diǎn)。在棱鏡模式下，入射激光的θ角很容易調(diào)節(jié)，故可得到相對純粹的消散場。棱鏡模式下的激光系統(tǒng)是一個開放的系統(tǒng)，不需要高數(shù)值孔徑的物鏡，相對物鏡模式的漸逝場熒光顯微術(shù)比較便宜。它的主要缺點(diǎn)是由于棱鏡位于樣品上，故而限制了樣品的操作，并不利于漸逝場熒光顯微術(shù)技術(shù)與其他技術(shù)如電生理技術(shù)的結(jié)合。此外，商業(yè)上也沒有成熟的棱鏡模式的漸逝場熒光顯微術(shù)系統(tǒng)，亦給應(yīng)用帶來不便。漸逝場熒光顯微術(shù)物鏡模式的主要缺點(diǎn)是相對較昂貴，入射激光的θ角較難調(diào)節(jié)，而得到的全反射的消散場相對不純粹。但是，它最大的優(yōu)點(diǎn)是樣品容易制備并易于在顯微鏡下操作，因此，在物鏡模式下可以將漸逝場熒光顯微術(shù)與許多其它的手段如膜片鉗等電生理技術(shù)結(jié)合在一起。另一方面，物鏡模式的漸逝場熒光顯微術(shù)系統(tǒng)，在商業(yè)上已經(jīng)很成熟，可以被很方便地添加到現(xiàn)有的各種熒光成像系統(tǒng)上［1-4，11］。

4 漸逝場熒光顯微術(shù)與激光共聚焦熒光顯微術(shù)的比較

漸逝場熒光顯微術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要是，由于漸逝場的穿透極淺，細(xì)胞深處的熒光分子基本不被激光激發(fā)，因此光漂白和光毒作用都很低。由于漸逝場熒光顯微術(shù)的光學(xué)激發(fā)切面的深度為100 nm左右，遠(yuǎn)低于共聚焦顯微鏡的500 nm左右光學(xué)切面厚度，因此檢測到的雜散熒光信號的背景也低于共聚焦。由于漸逝場熒光顯微術(shù)只需要高數(shù)值孔徑的物鏡和激光光源，相對于其他的光學(xué)方法來說比較便宜。同時，漸逝場熒光顯微術(shù)還可以與其他的非線性光學(xué)成像方法如熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光半衰期影像顯微鏡等方法結(jié)合使用。漸逝場熒光顯微術(shù)的缺點(diǎn)主要是只能對細(xì)胞表面成像，而不能用于研究細(xì)胞深處的信號。另外，全內(nèi)反射的信號對Z軸的漂移非常敏感［1-4］。

5 漸逝場熒光顯微術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

生命科學(xué)的現(xiàn)代發(fā)展，要求人們能夠從單細(xì)胞和單分子的水平來觀察生命的過程以及研究物質(zhì)之間的相互作用，漸逝場熒光顯微術(shù)在這兩方面都得到了應(yīng)用。

5.1 細(xì)胞表面事件檢測

漸逝場熒光顯微術(shù)非常適用于活細(xì)胞表面事件的研究，如出胞作用和入胞作用的觀察研究［5，6，12］。出胞作用即細(xì)胞分泌，是指真核細(xì)胞中含有分泌物的囊泡與細(xì)胞膜融合，從而將內(nèi)含物排出細(xì)胞外的過程。細(xì)胞分泌有組成性分泌和調(diào)節(jié)性分泌兩種。組成性分泌所有真核細(xì)胞都有，是從高爾基體TGN區(qū)囊泡向質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)倪^程，其作用在于更新膜蛋白和膜脂、形成細(xì)胞膜外周蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、或提供營養(yǎng)成分和信號分子。調(diào)節(jié)性分泌:分泌細(xì)胞產(chǎn)生的分泌物(如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、粘液或消化酶)儲存在分泌囊泡內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到胞外信號刺激時，分泌囊泡與細(xì)胞膜融合將內(nèi)含物釋放出去。在細(xì)胞發(fā)生出胞作用后，通常在短時間內(nèi)(數(shù)十毫秒)即出現(xiàn)入胞作用，將增加的質(zhì)膜回收以維持細(xì)胞體積的穩(wěn)定，并使囊泡回收從而循環(huán)利用。這些出胞作用和入胞作用的信號都發(fā)生在膜表面，因此可以用漸逝場熒光顯微術(shù)的方法實(shí)時觀察到。與出胞作用相反，入胞作用信號主要是通過檢測全內(nèi)反射層面下內(nèi)吞相關(guān)蛋白的動力學(xué)特性來實(shí)現(xiàn)［5-7］。

5.2 單分子檢測

漸逝場熒光顯微術(shù)在單分子檢測方面可應(yīng)用于分子馬達(dá)(molecular motor)的研究［9，13，14］。分子馬達(dá)包括肌球蛋白、驅(qū)動蛋白、動力蛋白、核苷酸聚合酶等，它們能夠沿著纖維型肌動蛋白、微管、DNA和RNA等線形分子的軌道運(yùn)動。漸逝場熒光顯微術(shù)能夠精確地檢測單個分子的位置和變化，故可用于觀察研究分子馬達(dá)的運(yùn)動。Vale［13］等首先用漸逝場熒光顯微術(shù)直接觀察到熒光標(biāo)記的單個驅(qū)動蛋白分子沿微管的運(yùn)動。驅(qū)動蛋白是由兩條輕鏈和兩條重鏈構(gòu)成的四聚體，其頂端或頭部兩個球形的結(jié)構(gòu)具有ATP酶活性，可與微管交替結(jié)合與解離，從而可沿著微管一步一步地向前走。Vale［13］等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用Cy3熒光染料標(biāo)記的驅(qū)動蛋白每次與微管相互作用后行走的平均距離為600 nm，而將驅(qū)動蛋白分子的一個頭部切除后，則不能觀察到行走現(xiàn)象，因而進(jìn)一步證明了驅(qū)動蛋白在微管上的行走機(jī)理。迄今，通過漸逝場熒光顯微術(shù)的單分子成像技術(shù)已經(jīng)觀察到了驅(qū)動蛋白超家族、RNA聚合酶和肌球蛋白V等分子馬達(dá)的前進(jìn)性運(yùn)動。

6 小結(jié)

漸逝場熒光顯微術(shù)是近年來最熱門的顯微成像技術(shù)之一。該技術(shù)依賴入射光在不同折射率的兩種光學(xué)介質(zhì)表面所產(chǎn)生的穿透極淺的漸逝波來動態(tài)觀察界面鄰近的結(jié)構(gòu)與現(xiàn)象。漸逝場產(chǎn)生的條件是入射介質(zhì)的折射率大于折射介質(zhì)的折射率，并且照射光的入射角等于或大于產(chǎn)生全反射的臨界值;在這種條件下所產(chǎn)生的漸逝波擴(kuò)散進(jìn)入低折射率介質(zhì)，并且隨著擴(kuò)散深度的增加，其強(qiáng)度呈指數(shù)遞減。漸逝場熒光顯微術(shù)利用漸逝波激發(fā)熒光物質(zhì)進(jìn)行觀察，由于漸逝場的穿透極淺，只能在光學(xué)表面下小于100 nm的層面以內(nèi)激發(fā)熒光染料，因此幾乎完全排除了細(xì)胞內(nèi)的自發(fā)熒光干擾，與傳統(tǒng)熒光顯微術(shù)相比，探測靈敏度和圖像信噪比大大提高，使觀察對象非常清晰。近年來漸逝場熒光顯微術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中，尤其是在界面附近探測成像觀察中得到了廣泛應(yīng)用。

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