金長(zhǎng)禮 李德華 李洪秀 樸仁京

軟骨組織損傷及退變是常見(jiàn)疾病，由于其缺少血管和神經(jīng)的支配，一旦損傷很難自身修復(fù)［1］。目前傳統(tǒng)的手術(shù)切除或填充外源性假體，均無(wú)明顯效果，而極易導(dǎo)致繼發(fā)性骨軟骨炎。隨著組織工程學(xué)在修復(fù)和治療領(lǐng)域的發(fā)展，為修復(fù)軟骨組織損傷帶來(lái)了新契機(jī)。種子細(xì)胞是組織工程學(xué)的首要因素，自體軟骨細(xì)胞是目前惟一批準(zhǔn)用于臨床的種子細(xì)胞，但其存在來(lái)源受限、形成二次損傷、體外擴(kuò)增困難、容易老化等缺點(diǎn)［2］。找到一種自體來(lái)源的軟骨種子細(xì)胞意義重大。

2001年Zuk等［3］從人吸脂術(shù)的脂肪組織中分離出具有多向分化潛能的細(xì)胞群，命名為脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)，hADSCs可以自體取材，對(duì)機(jī)體損傷小、取材方便，單位體積組織內(nèi)干細(xì)胞含量大，因此成為組織工程領(lǐng)域最具優(yōu)勢(shì)的種子細(xì)胞。但如何成功誘導(dǎo)hADSCs分化為軟骨樣細(xì)胞尚無(wú)定論，本研究旨在探索一種簡(jiǎn)單有效的誘導(dǎo)方案，使hADSCs成為軟骨細(xì)胞的新來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源 脂肪組織來(lái)自5例行腹部脂肪抽吸術(shù)的健康成年女性患者，年齡22～45歲，無(wú)傳染病和內(nèi)分泌疾病，并簽署知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 低糖DMEM、高糖DMEM、胎牛血清、MTT、DMSO(Gibco);Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、抗壞血酸、丙酮酸鈉、地塞米松、胰島素、甲苯胺藍(lán)(Sigma);GDF-5(PeproTeeh Inc);兔多抗Ⅱ型膠原抗體、SABC試劑盒(博士德生物試劑公司)。

1.3 hADSCs的分離培養(yǎng) 取人抽脂術(shù)后的無(wú)菌脂肪組織，PBS浸泡沖洗以去除紅細(xì)胞;加入2倍體積0.1%的Ⅰ型膠原酶，37℃水浴消化60 min，含10%胎牛血清的低糖-DMEM終止消化。4℃、2000 r/min離心10 min，低糖DMEM重懸沉淀，200目濾網(wǎng)過(guò)濾。4℃、2000r/min離心10 min，低糖DMEM重懸沉淀，移入培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。24 h后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，之后每3 d換液1次，細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4 hADSCs的增殖活性檢測(cè) 用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。取P3、P5、P10的hADSCs，以1×104/ml的密度接種于96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后的連續(xù)5 d，每天同一時(shí)間，隨機(jī)抽取一板，加入5 mg/ml的MTT(20 μl/孔)，37℃孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的DMSO震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在570nm處的吸光值。以時(shí)間(d)為橫軸，吸光值(OD)為縱軸，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 誘導(dǎo)hADSCs分化為軟骨細(xì)胞 取P3的hADSCs，制成密度為106/ml的細(xì)胞懸液，接種于蓋有玻片的6孔板，細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)更換軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。按GDF濃度不同分3組:A，0 ng/mlGDF;B，50 ng/mlGDF;C，100 ng/mlGDF-5。另均含10-7mol/L地塞米松、37.5 mg/L抗壞血酸、1 μmol/L胰島素，10%FBS 的 H-DMEM，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液，相差顯微鏡觀察。

1.6 檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá) 取誘導(dǎo)28 d的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-100孵育，3%H2O2室溫孵育，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。5%BSA封閉后加入兔多抗Ⅱ型膠原(1∶200)，4℃過(guò)夜。滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC試劑，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡下觀察，以上步驟均用PBS沖洗。結(jié)果判定:細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)不同程度的棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。

1.7 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)GAG 取誘導(dǎo)28 d細(xì)胞爬片，PBS漂洗2 min，4%多聚甲醛固定30 min。自來(lái)水沖洗15 min，蒸餾水洗5 min，加1%甲苯胺藍(lán)2 h，95%乙醇去除多余染液。干燥后，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的hADSCs接種24 h，可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈短梭形或多角形。3 d后細(xì)胞體積逐漸增大，呈長(zhǎng)梭形，似成纖維細(xì)胞，呈渦輪狀緊密排列。10 d左右細(xì)胞達(dá)到90%融合(圖1)。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，3～5 d即達(dá)80%融合。10 d以后，增殖速度無(wú)明顯減慢。

圖1 原代培養(yǎng)10 d的hADSCs(100)

2.2 hADSCs的生長(zhǎng)曲線 MTT結(jié)果顯示hADSCs傳代培養(yǎng)的第1～2天為潛伏期，2～4 d為指數(shù)增殖期細(xì)胞逐漸融合，第4天后進(jìn)入平臺(tái)期并達(dá)到峰值。P3，P5，P10細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線均呈“S”形(圖2)，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表明3種不同代的hADSCs每天的OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明多次傳代的hADSCs增殖能力沒(méi)有降低。

圖2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 C組(100 ng/ml GDF-5)誘導(dǎo)7 d可見(jiàn)細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎嘟切危?4 d大部分細(xì)胞變成圓形或者類圓形，21 d圓形細(xì)胞數(shù)量增加，在某些區(qū)域細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，形成軟骨樣結(jié)節(jié)(圖3a)。而B(niǎo)組(50 ng/mlGDF-5)誘導(dǎo)10 d細(xì)胞逐漸變?yōu)槎嘟切危?1 d細(xì)胞形態(tài)逐步變?yōu)閳A形或類圓形(圖3b)，形態(tài)改變相對(duì)滯后。

圖3 a 誘導(dǎo)21 d細(xì)胞(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

圖3 b 誘導(dǎo)21 d細(xì)胞(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

2.4 Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 誘導(dǎo)28 d的細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見(jiàn)細(xì)胞核藍(lán)染，胞漿呈棕黃色，Ⅱ型膠原表達(dá)陽(yáng)性。C組(100 ng/ml GDF-5)細(xì)胞著色深，表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多(圖4a)。B組(50 ng/ml GDF-5)細(xì)胞著色淺，表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少(圖4b)。

圖4 a 免疫細(xì)胞化學(xué)染色(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

圖4 b 免疫細(xì)胞化學(xué)染色(B:50 ng/ml GDF-5組，100)

2.5 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)GAG 誘導(dǎo)28 d細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色，GAG表達(dá)陽(yáng)性。C組(100 ng/ml GDF-5)藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量多，顏色深(圖5a)。B組(50 ng/ml GDF-5)藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量少，顏色淺(圖5b)。

圖5 a 甲苯胺藍(lán)染色(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

圖5 b 甲苯胺藍(lán)染色(B:50 ng/ml GDF-5組，100)

3 討論

近年組織工程學(xué)為修復(fù)軟骨組織損傷帶來(lái)了新契機(jī)，種子細(xì)胞是組織工程學(xué)的首要因素，自體軟骨細(xì)胞存在來(lái)源有限、二次損傷、體外擴(kuò)增困難等缺點(diǎn)，無(wú)法廣泛應(yīng)用于臨床，尋找新的軟骨細(xì)胞來(lái)源尤為重要［4］。2001年Zuk等從人吸脂術(shù)的無(wú)菌脂肪組織中分離培養(yǎng)出hADSCs，其具有與BMSCs相似的多向分化潛能，可向骨、肌肉、脂肪、軟骨和內(nèi)皮等方向分化［3］。因其可以自身取材、分離培養(yǎng)簡(jiǎn)單方便、單位體積組織內(nèi)干細(xì)胞含量大、分化表型可長(zhǎng)期維持、衰老較為緩慢等優(yōu)點(diǎn)，迅速成為組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并取得了可喜的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)采用Ⅰ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)hADSCs，接種24 h可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈短梭形或多角形。3 d后細(xì)胞體積增大，呈長(zhǎng)梭形，可見(jiàn)核分裂相。7 d后細(xì)胞融合達(dá)到90%，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)、大小一致，呈渦輪狀緊密排列。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)均一，增殖能力強(qiáng)，P10代以后的增殖能力僅稍弱于P3代細(xì)胞。

在誘導(dǎo)hADSCs分化為軟骨樣細(xì)胞的諸多因素中，生長(zhǎng)因子起到了決定性作用。常用于軟骨誘導(dǎo)的生長(zhǎng)因子有TGF-β、IGF-1、bFGF、BMP［5］等。其中 TGF-β 被公認(rèn)為成軟骨分化的特異性生長(zhǎng)因子［6］。但hADSCs表面缺乏可以介導(dǎo)TGF-β信號(hào)傳遞的受體，無(wú)法被TGF-β誘導(dǎo)分化為軟骨樣細(xì)胞。生長(zhǎng)分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF-5)又稱軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1(cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1)或骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14(bone morphogenetic protein，BMP-14)，是TGF-β超家族中的一員，它可促進(jìn)早期軟骨和關(guān)節(jié)形成［7］。向大鼠損傷軟骨組織內(nèi)注射GDF-5的實(shí)驗(yàn)證明GDF-5可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)中GAG的積累［8］，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的GDF-5來(lái)誘導(dǎo)hADSCs分化。其中誘導(dǎo)培養(yǎng)液中的地塞米松抑制hADSCs向脂肪樣細(xì)胞分化，胰島素是體外培養(yǎng)的細(xì)胞成活、有絲分裂、糖原合成必不可少的，色氨酸存在抑制有絲分裂的因子，BSA和脯氨酸作為細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)細(xì)胞合成膠原。丙酮酸鈉是細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。谷胺酰胺可補(bǔ)充必需氨基酸，維生素C是抗氧化劑，可抑制或減少凋亡［9］。

通過(guò)3個(gè)誘導(dǎo)組的培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)C組的細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎嘟切紊踔翀A形或者類圓形的時(shí)間早于B組，而且圓形細(xì)胞數(shù)量也多，在某些區(qū)域細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，形成軟骨樣結(jié)節(jié)。而B(niǎo)組細(xì)胞的形態(tài)改變相對(duì)滯后。A組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。GAG是軟骨組織中含量最大的蛋白聚糖［10］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)28 d的細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，C組藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量多，顏色深。B組藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量少，顏色淺。Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞的特異性蛋白［11］，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察C組細(xì)胞胞漿呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，核藍(lán)染，而且陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量多。B組細(xì)胞著色淺，陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量少。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從人抽脂術(shù)的無(wú)菌脂肪組織中成功分離培養(yǎng)hADSCs，獲得細(xì)胞數(shù)量大、形態(tài)均一、體外增殖迅速，具有干細(xì)胞特性。50、100 ng/ml的 GDF-5可在體外誘導(dǎo)hADSCs分化為軟骨樣細(xì)胞，具有軟骨細(xì)胞的形態(tài)，表達(dá)了軟骨細(xì)胞特異性的蛋白和糖胺聚糖。而100 ng/ml GDF-5的誘導(dǎo)效果更顯著。hADSCs可以作為軟骨修復(fù)的種子細(xì)胞來(lái)源。此項(xiàng)研究為今后應(yīng)用于軟骨組織工程提供了種子細(xì)胞相關(guān)的參考依據(jù)。

［1］Maurizio Pacifici.Cellular and molecular mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation.Ann N Y Acad Sci，2006，1068(4):74-86.

［2］Cindy Chung，Jason A，Burdick.Engineering cartilage tissue.Adv Drug Deliv Rev，2008，60(2):243-262.

［3］Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies.Tissue Eng，2001，7(2):211-228.

［4］Steven B.Abramson，Mukundan Attur.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis.Arthritis Research ＆ Therapy，2009，11(9):227-35.

［5］Andre F，Steinert.Concepts in gene therapy for cartilage repair.Injury，2008，39(11):97-113.

［6］Benjamin D，Elder MS，Kyriacos A，et al.Assessment of growth factor treatment on.Biochemical and biomechanical properties of engineered articular cartilage constructs.Osteoarthritis Cartilage，2009，17(1):114-123.

［7］Gang Feng，Yuqing Wan.Adenovirus-mediated expression of growth and differentiationfactor-5 promotes chondrogenesis of adipose stem cells.Growth Factors，2008，26(3):132-142.

［8］Koichi Masuda.Biological repair of the degenerated intervertebral disc by the injection of growth factors.Eur Spine J，2008，17(4):441-451.

［9］Andrew J，Rosenbaum et al.The use of mesenchymal stem cells in tissue engineering.Organogenesis，2008，4(1):23-27.

［10］Tania Rozario，Douglas W，De Simone.The extracellular Matrix in development and morphogenesis:a dynamic view.Dev Biol，2010，341(1):126-140.

［11］Olsen AK，Sondergaard BC，Byrjalsen I，et al.Anabolic and catabolic function of chondrocyte exvivo is reflected by the metabolic processing of type II collagen.Osteoarthritis Cartilage，2007，15(9):335-342.