傅 勇，肖 武，李 達，王 建，夏厚林，劉莉娜

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室，成都 610075）

遠志與厚樸不同配比水煎液的HPLC指紋圖譜比較研究Δ

傅 勇＊，肖 武，李 達，王 建#，夏厚林，劉莉娜

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室，成都 610075）

目的：比較遠志與厚樸不同配比水煎液的指紋圖譜，從化學(xué)角度探討二者配伍后對物質(zhì)基礎(chǔ)的影響。方法：采用高效液相色譜法，比較遠志與厚樸1∶1、1∶2、1∶3配比水煎液的指紋圖譜。色譜柱為Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，4μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），檢測波長為315 nm，柱溫為25℃，流速為1 mL·min－1。結(jié)果：隨著水煎液中厚樸比例的增大，色譜圖中保留時間在2～43 min之間的峰群變化明顯。其中保留時間在17、21、24、35、41 min左右的5個峰的峰面積隨厚樸比例增加而明顯增大，主要為厚樸中的成分。結(jié)論：遠志與厚樸配伍，隨厚樸比例增大而溶出增加的成分群可能是發(fā)揮遠志緩解胃腸動力障礙的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

遠志；厚樸；配伍；物質(zhì)基礎(chǔ)；高效液相色譜法；指紋圖譜

遠志具有良好的安神益智、祛痰開竅、消散癰腫等功效，是臨床常用藥。但生遠志使用過量或長期應(yīng)用會呈現(xiàn)較嚴重的胃腸動力障礙、黏膜損傷等不良反應(yīng)[1]。厚樸具有行氣消積的功效，常用于治療胃腸積滯、脘腹脹滿之證[2]。藥理研究表明，厚樸有較明顯的胃腸動力促進作用[3，4]。本課題組前期研究顯示，厚樸能有效緩解遠志所致胃腸動力抑制，并隨厚樸配伍比例的增大，該作用更為明顯[5]?；诖?，本研究從化學(xué)角度比較分析了遠志與厚樸不同配比水煎液的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為進一步闡釋中藥配伍關(guān)系提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

2695 HPLC儀、Empower化學(xué)工作站（美國Waters公司）；BP211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-250D臺式數(shù)控超聲波清洗器（北京奧賽利特科技發(fā)展有限公司）。

甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。遠志、厚樸均購于西南藥都中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定分別為遠志科植物遠志Polygala tenuifolia Willd.的根和木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.的干皮、根皮及枝皮，均屬2010年版《中國藥典》收載品種，并測得遠志中遠志酸含量為0.77%、厚樸中厚樸酚與和厚樸酚總量為2.63%，均符合《中國藥典》質(zhì)量標準要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，4μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（洗脫條件見表1）；檢測波長：315 nm；柱溫：25℃；流速：1 mL·min－1；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution

2.2 樣品的制備

2.2.1 水煎液的制備 （1）遠志水煎液：取遠志（藥材粗粉，下同）20 g，置于圓底燒瓶中，200 mL水浸泡30 min后冷凝回流煎煮。先武火至煮沸，沸后文火續(xù)煎1 h，濾過，60℃減壓濃縮至100 mL，相當(dāng)于遠志原生藥量為0.2 g·mL－1。（2）厚樸水煎液：取厚樸20 g，置于圓底燒瓶中，200 mL水浸泡30 min后冷凝回流煎煮。先武火至煮沸，沸后文火續(xù)煎15 min，濾過，60℃減壓濃縮至100 mL，相當(dāng)于厚樸原生藥量為0.2 g·mL－1。（3）遠志厚樸1∶1配伍水煎液：取遠志20 g，置于圓底燒瓶中，200 mL水浸泡30 min后冷凝回流煎煮。先武火至煮沸，沸后文火續(xù)煎45 min，再加入已浸泡30 min的20 g厚樸（遠志沸騰15 min后，以200 mL水開始浸泡厚樸），共煎15 min即可，濾過，60℃減壓濃縮至100 mL，相當(dāng)于含原生藥量0.4 g·mL－1。（4）遠志厚樸1∶2配伍水煎液：取遠志20 g、厚樸40 g，按“2.2.1（3）”項下方法煎煮，濾過，60℃減壓濃縮至100 mL，相當(dāng)于含原生藥量0.6 g·mL－1。（5）遠志厚樸1∶3配伍水煎液：取遠志20 g、厚樸60 g，按“2.2.1（3）”項下方法煎煮，濾過，60℃減壓濃縮至100 mL，相當(dāng)于含原生藥量0.8 g·mL－1。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別取“2.2.1”項下5種水煎液各10 mL，60℃減壓蒸干，甲醇超聲（頻率：40 kHz，功率：250 W）溶解并定容至10 mL。搖勻后取2 mL，10 000 r·min－1離心5 min后取上清液，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得相應(yīng)供試品溶液。

2.3 內(nèi)參比峰的選擇

由于缺乏對照品，且本方法得到的色譜峰較多，難以插入內(nèi)標物，因而根據(jù)色譜圖的結(jié)果，選擇保留時間在43 min左右、對稱較好的色譜峰作為內(nèi)參比峰（S）。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 按“2.2.1（3）”項下方法制備一份遠志厚樸1∶1配伍水煎液，再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按擬定方法連續(xù)進樣5次，計算37個主要共有峰相對保留時間和相對峰面積（面積歸一化法，單峰面積＞5%，下同）的RSD，結(jié)果均＜3%，表明本方法精密度良好，能滿足指紋圖譜技術(shù)要求[6]。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.1（3）”項下方法制備一份遠志厚樸1∶1配伍水煎液，再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進樣，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果均＜3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 按“2.2.1（3）”項下方法制備6份遠志厚樸1∶1配伍水煎液，再分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按擬定方法進樣，計算共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果均＜3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 遠志厚樸1∶1配伍水煎液HPLC指紋圖譜的建立

按“2.2.1（3）”項下方法制備10份遠志厚樸1∶1配伍水煎液，再分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按擬定方法進樣，獲得色譜圖。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》進行相似度評價。與系統(tǒng)生成的對照指紋圖譜相比，10批供試品溶液的相似度依次為0.998、0.995、0.998、0.996、0.997、0.997、0.998、0.993、0.999、0.997，RSD＝0.176%（n＝10）。10批遠志厚樸1∶1配伍水煎液的共有模式見圖1。

2.6 各供試品溶液的HPLC指紋圖譜比較

按“2.2”項下方法分別制備遠志、厚樸、遠志厚樸1∶2配伍、遠志厚樸1∶3配伍水煎液各一份，再分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按擬定方法進樣，將所得圖譜與遠志厚樸1∶1配伍水煎液的共有模式進行比較，結(jié)果分別見圖2～圖4。

由上述各圖可得，遠志的指紋峰大多出現(xiàn)在2～83 min時段，主要在43～83 min之間；而厚樸在2～43 min之間有較多的指紋峰出現(xiàn)。各配伍組圖譜中，隨著厚樸配比的增大，保留時間在2～13 min之間的峰群，峰面積有一定的增加；而保留時間在17、21、24、36、41 min左右的5個峰，峰面積分別增加32%～189%不等，且峰面積增加百分比與厚樸藥材增量間呈現(xiàn)良好的相關(guān)性（r＞0.82）。保留時間在43 min以后的峰，無論是峰形還是保留時間均無明顯差異。

3 討論

本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，厚樸能明顯緩解遠志所致的胃腸動力障礙。在此基礎(chǔ)上，筆者對遠志與厚樸配伍的提取工藝和配伍比例進行了篩選。在提取工藝試驗中，利用揮發(fā)油提取器提取厚樸中揮發(fā)油，記為揮發(fā)性成分，剩余部分為非揮發(fā)性成分；比較考察了遠志與厚樸同煎60 min、遠志與厚樸揮發(fā)性成分混合、遠志與厚樸揮發(fā)性及非揮發(fā)性成分混合對小鼠胃腸動力的影響，結(jié)果只有最后一組能明顯緩解遠志所致的胃腸動力抑制，其余各組無顯著影響。提示厚樸中的揮發(fā)性及非揮發(fā)性成分可能同時參與了對遠志所致胃腸動力抑制的調(diào)節(jié)。為了使厚樸的揮發(fā)性成分盡可能地保留在水煎液中，同時又更貼近臨床用藥，本課題組采用厚樸后下的煎煮方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厚樸后下與遠志同煎15 min時，遠志的胃腸動力抑制作用得到較明顯緩解?；谠撎崛l件，考察了遠志與厚樸不同配比水煎液對小鼠胃腸運動的影響，結(jié)果顯示，厚樸能緩解遠志的胃腸動力抑制，且隨厚樸配比的增大，作用更明顯[5]。

為了進一步證明提取工藝和配伍對物質(zhì)基礎(chǔ)的影響，本課題組采用薄層色譜法對比考察了厚樸后下與遠志同煎15 min水煎液、厚樸與遠志同煎60 min水煎液中遠志酸、厚樸酚、和厚樸酚、揮發(fā)油等成分的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者能檢測到揮發(fā)油及其他相關(guān)成分，而后者沒有檢測到揮發(fā)油。提示隨著煎煮時間的延長，厚樸中的揮發(fā)性成分可能會丟失。HPLC法測定遠志與厚樸配伍前后相關(guān)物質(zhì)含量變化的結(jié)果顯示，隨著厚樸配比的增大，厚樸酚、和厚樸酚的含量依次遞增[7]。

本試驗采用二極管陣列檢測器對檢測波長在190～400 nm范圍內(nèi)的圖譜進行了考察，分別記錄遠志厚樸1∶1配伍水煎液在210、254、300、315、350 nm波長處的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遠志厚樸1∶1配伍水煎液在315 nm波長處有較好的紫外吸收。同時，對比考察了直接水煎液進樣和其減壓蒸干后再用不同比例甲醇溶解后進樣的色譜圖，結(jié)果顯示，水煎液蒸干后再用甲醇溶解與水煎液直接進樣，色譜峰保留時間和峰形基本類似。由于甲醇溶解后樣品更加穩(wěn)定，因而采取了文中的處理方法。

HPLC指紋圖譜的考察結(jié)果顯示，遠志與厚樸配伍并未產(chǎn)生新的色譜峰。因遠志用量在各配比組中保持一致，且遠志對應(yīng)的峰在各配比組中變化不明顯，僅有保留時間為43 min左右的內(nèi)參比峰略有增加趨勢，提示與厚樸配伍，對遠志中的主體成分影響較小，或僅影響其成分構(gòu)成比；而遠志與厚樸不同配比組則隨厚樸配比的增加，有5個峰的峰面積明顯增大，表明隨厚樸配比增加而峰面積增大的成分群，應(yīng)屬于厚樸所含物質(zhì)。

結(jié)合前期實驗，筆者推測厚樸改善遠志所致的小鼠胃腸動力抑制作用，可能主要與其所含的揮發(fā)油、厚樸酚、和厚樸酚以及部分未知的非揮發(fā)性成分的共同參與有關(guān)，且隨厚樸配比的增加，這些物質(zhì)在水煎液中的相對含量也增大，緩解作用更加明顯。

綜上表明，合理的中藥配伍方式，的確能達到降低毒副效應(yīng)的目的，也能體現(xiàn)中藥“相畏相殺”的配伍理論；而藥物所含的物質(zhì)基礎(chǔ)，是影響配伍變化的關(guān)鍵因素之一。

[1] 王 建，郭 娟，劉賢武，等.生遠志及與甘草不同配伍比例對小鼠胃腸運動的影響[J].中藥藥理與臨床，2002，18（5）：28.

[2] 高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2002：238-239.

[3] 張永太，吳 皓.厚樸藥理學(xué)研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（5）：96.

[4] 張永太，吳 皓.厚樸姜炙前后對胃腸運動功能影響的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（11）：2 617.

[5] 江 娟，王 建，李 達，等.遠志與厚樸不同煎煮時間及不同配比對小鼠胃腸運動的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2009，30（3）：380.

[6] 國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[S].2001.

[7] 李 達.遠志與厚樸配伍前后化學(xué)成分對比及解毒機理初步研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

Comparison of HPLC Fingerprints of the Decoctions of Polygala tenuifolia and Magnolia officinalis at Different Ratio

FU Yong，XIAO Wu，LI Da，WANG Jian，XIA Hou-lin，LIU Li-na
（Dept.of Chinese Materia Medica，College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）

OBJECTIVE：To explore the changes of material basis by comparing the fingerprints of the decoctions of Polygala tenuifolia and Magnolia officinalis at different ratio.METHODS：HPLC method was adopted to compare the fingerprints of the decoctions of P.tenuifolia and M.officinalis at the ratio of 1∶1，1∶2 and 1∶3.The determination was performed on Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，4μm）column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at the flow rate of 1 mL·min－1.The detection wavelength was set at 315 nm and the column temperature was 25℃.RESULTS：With the increase of the ratio of M.officinalis in the decoction，those peaks the retention time of which rank from 2 min to 43 min had a obvious change，particularly，Those 5 peaks the retention time of which time were about 17 min，21 min，24 min，35 min and 41 min all had a significant increase in its peak area，which mainly came from M.officinalis.CONCLUSION：Those components，which have increased with M.officinalis in the decoctions，probably are the main material basis which lead to the alleviation of the inhibition of gastrointestinal motility caused by the use of P.tenuifolia.

Polygala tenuifolia；Magnolia officinalis；Compatibility；Material basis；HPLC；Fingerprint

R283.661；R927

A

1001-0408（2012）43-4072-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.43.16

2011-11-13

2012-01-30）