徐 寧，秦俊蓮，孫樹剛，段舜山

暨南大學(xué)水生生物研究中心，廣州510632

有害藻華與富營養(yǎng)化關(guān)系的研究是國際上近海海洋生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn).近年來，沿岸海域的有機(jī)污染程度不斷加重，溶解有機(jī)氮 (dissolved organic nitrogen，DON)，尤其是尿素 (CO(NH2)2)的含量快速增長［1-3］.同時(shí)，赤潮災(zāi)害也呈現(xiàn)出頻率和類型增多、分布區(qū)域和規(guī)模擴(kuò)大、危害日趨嚴(yán)重的演變趨勢.研究顯示，某些赤潮藻類能夠利用尿素和一些溶解氨基酸［4］;海水中DON濃度的上升與赤潮頻率的增加密切相關(guān)［5-6］.

東海原甲藻是近年引發(fā)中國沿海頻繁赤潮的原因種之一［7］，嚴(yán)重危害了漁業(yè)生產(chǎn)、公眾健康和近海環(huán)境［8-10］.研究顯示，發(fā)生赤潮的長江口及鄰近海域受人類活動(dòng)的影響，營養(yǎng)鹽含量很高［11］.然而，迄今為止，DON在東海原甲藻赤潮生長、消亡過程中的作用仍不清楚.本研究比較了東海原甲藻對尿素和無機(jī)氮源的吸收動(dòng)力學(xué)和生長特性，以期為闡明赤潮藻對重要DON組分的利用策略提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)藻種為中國沿海典型赤潮藻東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)，采自我國東海赤潮高發(fā)海區(qū)，經(jīng)毛細(xì)管分離培養(yǎng)成單細(xì)胞株系.

1.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)藻種于LRH-400-G室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度 (23±1)℃，輻照強(qiáng)度約25 W/m2，光暗比12∶12.選用f/2培養(yǎng)基，基礎(chǔ)介質(zhì)為人工海水(鹽度為30.5‰).

1.3 東海原甲藻在不同N源下的生長動(dòng)力學(xué)特征

分別以CO(NH2)2或NaNO3為N源經(jīng)3輪或以上預(yù)培養(yǎng).具體方法為:將指數(shù)生長期的藻細(xì)胞分別接種至N質(zhì)量濃度為500 μg/L的CO(NH2)2或NaNO3培養(yǎng)基中，另添加NaH2PO4，使P的質(zhì)量濃度為100 μg/L，其他組分同f/2培養(yǎng)基.至培養(yǎng)基中檢測不出 N，分別接種至不同 N濃度 (0 μmol/L、1.764 μmol/L、4.410 μmol/L、8.820 μmol/L、44.100 μmol/L、88.200 μmol/L、441 μmol/L、882 μmol/L 和 8 820 μmol/L) 的 CO(NH2)2或NaNO3培養(yǎng)基中 (其他組分同f/2培養(yǎng)基)，置于室內(nèi)同一光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每一處理設(shè)3個(gè)平行.每隔24 h取藻液5 mL觀察計(jì)數(shù)并測定其光密度值OD680，采用Guillard的計(jì)算方法確定比生長率 μ (單位為 d－1)［12］.

1.4 東海原甲藻對尿素的吸收動(dòng)力學(xué)特征

分別以CO(NH2)2或NH4Cl為N源經(jīng)過3輪或以上預(yù)培養(yǎng).具體方法同上.

時(shí)間序列實(shí)驗(yàn).將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的藻細(xì)胞分別接種于3個(gè)1 000 mL三角瓶中，密度1 000/mL，終體積為600 mL，分別添加CO(NH2)2或NH4Cl溶液，使N的濃度為6 μmol/L.充分混勻后，立即抽取10 mL藻液，經(jīng)孔徑為0.7 μm的GF/F玻璃纖維濾紙過濾 (Whatman)，將濾液收集到20 mL聚乙烯瓶中冷凍保存;同樣，分別于2 min、5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、60 min、90 min和120 min時(shí)抽取并過濾藻液，冷凍保存.用AA3連續(xù)流動(dòng)化學(xué)元素分析儀 (Bran Luebbe)測定濾液中N濃度.

濃度序列實(shí)驗(yàn).將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的東海原甲藻分別接種于3個(gè)1 000 mL三角瓶中，密度為1 000/mL，終體積為400 mL，然后按每瓶50 mL藻液分裝至100 mL的三角瓶中.加入 CO(NH2)2或NH4Cl溶液，使 N濃度依次為:0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L、12.0 μmol/L 和 18.0 μmol/L，2 min時(shí)用孔徑為0.7 μm的 GF/F玻璃纖維濾紙過濾(Whatman抽取10 mL藻液)，濾液冷凍保存，每種處理設(shè)3個(gè)平行.用同樣方法測定N濃度.

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，t檢驗(yàn)比較各處理之間的差異顯著性.

利用Monod方程描述東海原甲藻比生長率與N濃度間的關(guān)系其中，μ為比生長率 (單位d－1);μm為最大比生長率 (單位d－1);c(N)為培養(yǎng)液中 N濃度 (單位μmol/L);K為半飽和常數(shù) (單位μmol/L).

將方程(1)整理成c(N)/μ =K/μm+c(N)/μm.利用最小二乘法求出方程的斜率(1/μm)和截距(K/μm)，斜率的倒數(shù)與截距的乘積即為半飽和常數(shù)K.

利用經(jīng)修改的Michaelis-Menten方程描述東海原甲藻對N的吸收速率與培養(yǎng)液中N濃度間的關(guān)系

其中，V為吸收速率 (單位h－1);Vm為最大吸收速率.同樣，利用最小二乘法求出半飽和常數(shù)K.

2 結(jié)果與分析

2.1 東海原甲藻對尿素N和硝態(tài)N的利用特征

圖1為不同濃度尿素N下東海原甲藻生長情況.結(jié)果顯示，尿素N能較好地被東海原甲藻利用，且其濃度與東海原甲藻生長速率呈明顯正相關(guān).c(N)分別為441 μmol/L和882 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組東海原甲藻生長速率顯著大于其他組(P＜0.05);c(N)=8 820 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組生長速率和最大細(xì)胞密度顯著低于c(N)為882 μmol/L和441 μmol/L組(P＜0.05)，表明過高N濃度抑制東海原甲藻生長.當(dāng)尿素N的濃度低于8.820 μmol/L時(shí)，東海原甲藻種群生長緩慢.

圖1 不同濃度尿素N下東海原甲藻的生長曲線Fig.1 Effect of urea concentration on the growth of P.donghaiense

如圖2，將東海原甲藻的μm和尿素N濃度擬合Monod方程，得雙曲線方程μ=0.685c(N)/［20.508+c(N)］，R2=0.866 33.由此可知，東海原甲藻種群最大比生長速率為0.685/d，半飽和尿素N的濃度為20.508 μmol/L.

由圖3可見，NaNO3能較好地被東海原甲藻利用，且其濃度與藻細(xì)胞生長速率呈明顯正相關(guān).c(N)=8 820 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞生長最好;其次是c(N)=882 μmol/L組;再次是c(N)=441 μmol/L組 (P ＜ 0.05).c(N)為 88.200 μmol/L 和44.100 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞生長速率均明顯降低(P＜0.05).N濃度低于8.820 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞生長緩慢.但c(N)=8 820 μmol/L時(shí)，東海原甲藻并未像尿素一樣出現(xiàn)抑制生長現(xiàn)象.

如圖4，將指數(shù)生長期的東海原甲藻 μ和c(NaNO3)擬合Monod方程，得雙曲線方程μ=0.663c(N)/［11.940+c(N)］，R2=0.896 70.由此可知，東海原甲藻種群的μm為0.663/d，此時(shí)半飽和NaNO3濃度為11.940 μmol/L.相對而言，東海原甲藻在CO(NH2)2下的μm較高，而K略低，可見東海原甲藻能有效利用CO(NH2)2，并在N源充足時(shí)，可獲得更高的繁殖速率.

圖2 東海原甲藻在尿素N下的生長動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Specific growth rates of P.donghaiense as a function of urea concentrations

圖3 不同濃度硝態(tài)氮下東海原甲藻的生長曲線Fig.3 Effect of nitrate concentration on the growth of P.donghaiense

2.2 東海原甲藻對尿素N和氨態(tài)N的吸收動(dòng)力學(xué)特征

時(shí)間變化特征.圖5顯示，向N已耗盡的東海原甲藻培養(yǎng)液中一次添加CO(NH2)2或NH4Cl，使N濃度為6 μmol/L時(shí)，隨時(shí)間延長，培養(yǎng)液中N濃度和藻細(xì)胞對N的吸收速率均迅速衰減.向培養(yǎng)液中添加CO(NH2)210 min后，其濃度降低至原來的60%;30 min時(shí)，其濃度繼續(xù)降低，至原來的40%;60 min時(shí)，其濃度的下降趨勢不明顯.向培養(yǎng)液中添加NH4Cl 10 min后，其濃度降低到原來的45%;20 min時(shí)，濃度繼續(xù)降低，至原來的40%;30 min時(shí)，其濃度繼續(xù)下降，低至原來的30%;60 min時(shí)，其濃度下降變得不明顯.可見，處于N耗盡狀態(tài)的藻細(xì)胞對水體中N的輸入非常敏感，可在第一時(shí)間迅速吸收并儲(chǔ)存N源.然而，快速吸收期非常短，僅維持約30 min;60 min后吸收速率已衰減85%，且吸收緩慢.對比兩者表明，向處于N耗盡狀態(tài)的東海原甲藻培養(yǎng)液中一次性添加CO(NH2)2或NH4Cl，使N濃度為6 μmol/L時(shí)，東海原甲藻對氨態(tài)N的吸收速率高于對尿素N的吸收速率.

圖4 東海原甲藻硝態(tài)N下的生長動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Specific growth rates of P.donghaiense as a function of nitrate concentrations

圖5 東海原甲藻培養(yǎng)基中N濃度隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes of urea and ammonium concentrations in P.donghaiense medium over time

濃度響應(yīng)特征.圖6和圖7顯示，向N耗盡的培養(yǎng)液中一次添加不同濃度的CO(NH2)2或NH4Cl，添加2 min后，東海原甲藻對N的吸收速率與N濃度呈正相關(guān).將東海原甲藻對尿素N或氨態(tài)N的吸收速率與其相應(yīng)濃度擬合Michaelis-Menten方程，得雙曲線方程

由此可知，2 min時(shí)東海原甲藻對尿素N的最大吸收速率為 3.184/h，半飽和 N濃度為 39.043 μmol/L(見表1和圖6);對氨態(tài)N的最大吸收速率為 2.800/h，此時(shí)半飽和 N濃度為 18.032 μmol/L(見表1和圖7).

表1 東海原甲藻對CO(NH2)2和NH4Cl的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Uptake kinetics of P.donghaiense for urea and ammonium

圖6 東海原甲藻在不同濃度尿素N下的吸收速率Fig.6 Uptake rates of P.donghaiense as a function of urea

研究表明，東海原甲藻能有效利用CO(NH2)2和NH4Cl兩種N源.相對而言，對NH4+的親和力較高，表現(xiàn)為較低的半飽和常數(shù)K和較高的競爭系數(shù)α，在低N濃度下具有較高的吸收速率;對尿素的最大吸收速率較高，表現(xiàn)為隨著N濃度的增加吸收速率持續(xù)增大.根據(jù)擬合方程 (3)和方程 (4)的結(jié)果，隨著N濃度增加，東海原甲藻對尿素N的吸收速率會(huì)超過銨N，主要原因可能是高濃度NH4+對藻類具有毒害作用.

圖7 東海原甲藻在不同濃度氨態(tài)N下的吸收速率Fig.7 Uptake rates of P.donghaiense as a function of ammonium concentrations

3 討論

3.1 赤潮藻具備高效利用尿素的能力

本研究比較了東海原甲藻對 CO(NH2)2和NO3－的利用特征，結(jié)果表明，東海原甲藻能有效利用尿素，相對于無機(jī)氮，在尿素條件下的比生長速率更高.有研究證實(shí)，某些赤潮藻類能優(yōu)先利用尿素.如Fan等［13］研究發(fā)現(xiàn)，美國切薩皮克灣的微小原甲藻(Prorocentrum minimum)即使在高NO3－濃度條件下，也會(huì)優(yōu)先選擇尿素.類似地，在低光條件下，3株Karenia brevis中2株對尿素氮的最大吸收速率高于氨態(tài)N和硝態(tài)N，且同化為蛋白質(zhì)的比例均以尿素氮最高［14］;Li等［15］發(fā)現(xiàn)Karenia mikimotoi也能優(yōu)先利用尿素.

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)尿素N濃度達(dá)8 820 μmol/L時(shí)會(huì)抑制東海原甲藻生長，而同濃度硝態(tài)N卻沒有此現(xiàn)象.研究表明，大多數(shù)細(xì)菌中存在三磷酸腺苷脲酰胺酶，能將尿素分解為氨和碳酸氫根［3］.由于本研究使用的是未經(jīng)無菌處理的藻株，培養(yǎng)基中的細(xì)菌降解尿素并釋放出氨，過高濃度的氨可能對藻細(xì)胞直接產(chǎn)生毒害作用.另外，氨是脲酶活性的下行調(diào)節(jié)物［3，11］，可能抑制尿素轉(zhuǎn)移酶和脲酶活性，這不利于藻細(xì)胞攝取和利用尿素.Jauzein等［16］發(fā)現(xiàn)NH4+強(qiáng)烈抑制 Alexandrium catenella對尿素的吸收.在野外觀察中也發(fā)現(xiàn)，加入NH4+或環(huán)境中NH4+濃度增加，尿素的吸收速率會(huì)下降.如在切薩皮克灣，NH4+濃度為5 μmol/L時(shí)就會(huì)抑制尿素的吸收.

與NO3－相比，尿素是一種“節(jié)能型”N源.此外，赤潮藻在利用尿素N時(shí)，還能利用其中的碳源.這也可能是赤潮藻優(yōu)先利用尿素的原因之一.然而，浮游植物利用尿素性能的多樣性及其調(diào)控機(jī)制尚待深入研究.

3.2 浮游植物對尿素的吸收特征及生態(tài)學(xué)意義

研究結(jié)果顯示，東海原甲藻對尿素N的吸收速率與對氨態(tài)N吸收速率接近 (見圖6和圖7)，表明尿素可能在赤潮生長消亡過程中起關(guān)鍵作用.近期的研究結(jié)果顯示，許多赤潮種類對尿素具有很高的吸收速率.Collos等［17］在法國南部Thau瀉湖爆發(fā)的4次藻華期間進(jìn)行現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)，比較了鏈狀亞歷山大藻對硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨和尿素的吸收速率，發(fā)現(xiàn)氨和尿素是促進(jìn)亞歷山大鏈狀藻生長的主要N源.另外有研究指出，在加州沿海形成赤潮的有毒藻Lingulodinium polyedrum和Cochlodinium fulvescens吸收尿素及其降解產(chǎn)物氨的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過對硝酸鹽的吸收［10］.

營養(yǎng)組成對于刺激某些藻類的生長是十分重要的，一次突然的營養(yǎng)輸入可能引起浮游植物種類組成和相對豐度發(fā)生逆轉(zhuǎn).例如，美國 Northport-Huntington灣的Alexandrium fundyense赤潮與污水排入密切相關(guān)［18］.進(jìn)一步的研究顯示，雨水和地表徑流中攜帶的有機(jī)物促進(jìn)了水華的發(fā)生［19］.在澳大利亞Moreton灣的現(xiàn)場研究發(fā)現(xiàn)，尿素占總N吸收的比例與甲藻所占比例高度相關(guān).越來越多的文獻(xiàn)表明，當(dāng)環(huán)境中尿素成為常見N素形態(tài)時(shí)，甲藻數(shù)量可能會(huì)激增［11］.

隨著沿海水域尿素濃度的不斷上升，尿素在浮游植物群落演替和赤潮生長、消亡過程中的作用不容忽視.而對于浮游植物吸收、利用尿素的性能和調(diào)控機(jī)制的研究，將有助于深入了解有害藻華的形成機(jī)制.

結(jié) 語

綜上研究可知:① 東海原甲藻能以尿素為唯一N源生長，其最大細(xì)胞密度與尿素濃度呈正相關(guān)，最大比生長率為 0.685/d，高于 NO3－的0.663/d.在N濃度為8 820 μmol/L時(shí)，尿素出現(xiàn)抑制生長的現(xiàn)象，而NO3－無此現(xiàn)象;② 東海原甲藻能有效吸收利用尿素和NH4+.相對而言，對尿素的最大吸收速率較高，而對NH4+的親和力較高;③由于東海原甲藻具備有效吸收利用尿素的能力，水體中尿素含量的升高甚至?xí)l(fā)赤潮.

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