王章存 崔勝文 田衛(wèi)環(huán) 趙學(xué)偉 鄭堅(jiān)強(qiáng) 李昌文 袁道強(qiáng)

高壓處理對(duì)大米蛋白溶解性及其分子特征的影響

王章存 崔勝文 田衛(wèi)環(huán) 趙學(xué)偉 鄭堅(jiān)強(qiáng) 李昌文 袁道強(qiáng)

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002)

研究了pH 8．0和pH 10．0條件下500 MPa高壓處理對(duì)熱變性大米蛋白溶解性的影響，并用Sephadex G－100色譜和SDS－PAGE分析了其分子特征的變化，用掃描電鏡觀察了大米蛋白的表觀特征。結(jié)果顯示，pH 8．0時(shí)500 MPa處理可使大米蛋白的溶解性由12．03%提高到19．15%，pH 10．0時(shí)高壓處理則可由16．60%提高到24．87%。高壓處理后的大米蛋白顆粒表面疏松，可使較大的蛋白質(zhì)分子溶出，也產(chǎn)生了更小的蛋白質(zhì)分子，且高壓與非高壓時(shí)溶出的蛋白質(zhì)組分具有不同的紫外吸收特征。高壓處理后的可溶性蛋白中均含有14、35 ku和少量22 ku亞基，非可溶性部分中除上述亞基外，還含有12、16、110 ku亞基。表明不同高壓處理影響大米蛋白的溶解性能和分子特征，但對(duì)亞基的影響不明顯。

大米蛋白 高壓 溶解性 分子特征

以大米為原料的淀粉糖和發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中有大量的副產(chǎn)品大米蛋白，因其加工過(guò)程經(jīng)歷了90℃以上的高溫，蛋白質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重的熱變性而難溶于水，很難在食品工業(yè)中應(yīng)用。國(guó)內(nèi)有很多關(guān)于提高這種熱變性大米蛋白溶解性的研究報(bào)道，主要用強(qiáng)堿溶液或酶解技術(shù)，但其溶解性能一直未能很好解決［1－4］。強(qiáng)堿法溶解大米蛋白顯然不適用于食品工業(yè)，而酶解過(guò)程中即使增加酶用量或延長(zhǎng)酶解時(shí)間等也只能使約60%的蛋白質(zhì)溶解，這與其他蛋白質(zhì)的酶解有很大不同。目前文獻(xiàn)中只有少量關(guān)于熱變性米蛋白分子結(jié)構(gòu)特征的報(bào)道［5－7］，一個(gè)重要原因是該蛋白難以溶解，常規(guī)的技術(shù)手段和方法無(wú)法有效應(yīng)用，所以大米蛋白不溶解甚至抵抗酶解的原因至今尚不清楚。

大量研究表明，高壓處理可以改變蛋白質(zhì)顆粒的聚集狀態(tài)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)中—S—S—的存在狀態(tài)，從而影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和蛋白質(zhì)的酶解模式例如，用200 MPa處理脫脂乳可導(dǎo)致β－乳球蛋白(β－Lg)形成以—S—S—連接的二聚體，800 MPa處理又使β－Lg亞基分離，而此時(shí)其他小分子乳清球蛋白卻發(fā)生聚集［8］。β－Lg經(jīng)過(guò)200 MPa高壓處理后就可以被胃蛋白酶水解［9］，經(jīng)400 MPa處理后酶解10 min就不存在完整的 β －Lg分子［10］，經(jīng)600 MPa處理后酶解1 min即可被水解成1 500 u以下的小分子［11］。Kieffer等［12］發(fā)現(xiàn)200 MPa處理小麥面筋蛋白可降低其面筋強(qiáng)度，增加游離—SH的含量;若進(jìn)一步增加壓力可導(dǎo)致面筋蛋白質(zhì)分子內(nèi)部發(fā)生—S—S—的斷裂和重排?？梢?jiàn)，高壓處理對(duì)蛋白質(zhì)的影響效果與壓力大小、保壓時(shí)間、溫度、蛋白質(zhì)種類(lèi)甚至溶劑條件等因素有關(guān)。

本試驗(yàn)研究不同pH條件下高壓處理對(duì)大米蛋白溶解性及某些分子特征的影響，為進(jìn)一步改善大米蛋白溶解性的技術(shù)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

大米蛋白:以荊州漢科生物公司生產(chǎn)淀粉糖中的副產(chǎn)品為原料，按文獻(xiàn)［13］方法經(jīng)水洗脫糖后所得。凱式定氮法測(cè)定CP=75．02%。

Sephadex G－100:瑞典Pharmacia公司;N，N，N'，N'－四甲基乙二胺(TEMED):FLUKA公司;考馬斯亮蘭R250:FLUKA公司;丙烯酰胺(Acr)，N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺(Bis):Amresco公司;低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Mr．14 400～97 400):大連寶生物有限公司。

1．2 儀器與設(shè)備

UHP900×2－Z超高壓處理裝置:包頭文天科技公司;UV－8100 B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京Lab－Tech儀器公司;BSZ－100自動(dòng)部份收集儀和HL－2恒流泵:上海滬西分析儀器廠;DYY－7C電泳儀和DYCZ－24DN電泳槽:北京六一儀器廠;JSM－6490LV掃描電子顯微鏡:日本電子公司。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品的超高壓處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取大米蛋白5．0 g分別懸浮于100 mL的pH 8．0，pH 10．0水溶液中。將上述蛋白樣品溶液于兩層聚乙烯塑料袋(8 cm×10 cm)中真空密封(不留頂隙)，置于壓力容器內(nèi)腔，浸沒(méi)于加壓介質(zhì)中，于25℃下設(shè)定壓力500 MPa，高壓處理30 min。升壓、降壓均在1 min內(nèi)完成。樣品經(jīng)高壓處理后1 000 r/min離心10 min，分析可溶物和不溶物組分的相關(guān)指標(biāo)。

1．3．2 蛋白質(zhì)的溶解性

利用雙縮脲法測(cè)定可溶性蛋白的含量。以可溶部分蛋白與原料蛋白含量比值表示。

1．3．3 SDS－PAGE分析

采用Laemmli電泳系統(tǒng)［14］，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%?？扇懿糠趾筒蝗懿糠值鞍捉?jīng)還原性樣品緩沖液(含巰基乙醇和SDS)處理。不溶部分利用0．01 mol/L NaOH預(yù)處理。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R－250染色。

1．3．4 Sephadex G－100色譜分析

將離心上清液用0．45μm微孔濾膜過(guò)濾上樣。色譜柱1．2 cm×100 cm，進(jìn)樣量為2．5 mL。洗脫液為0．9%的生理鹽水，流速為20 mL/h，以每管2．5 mL收集，用紫外檢測(cè)器280 nm檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，并繪制洗脫曲線。

1．3．5 掃描電鏡分析(SEM)

將沉淀部分冷凍干燥。取適量干燥后樣品，分散在貼有雙面膠的SEM的樣品臺(tái)上，通過(guò)離子濺射在樣品上噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)［15］。掃描電鏡工作條件:高壓10 kV，束流5×10－9mA，工作距離15 mm。

1．3．6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，利用SPSS17．0軟件進(jìn)行方差分析和Duckey分析(95%置信區(qū)間)。

2 結(jié)果與討論

2．1 高壓對(duì)蛋白溶解性的影響

研究了pH 8．0和pH 10．0兩種pH條件下500 MPa高壓處理對(duì)大米蛋白溶解性的影響，并以未高壓處理為對(duì)照，測(cè)定結(jié)果(表1)顯示，在相同壓力條件下，大米蛋白在pH 10．0時(shí)的溶解性高于pH 8．0，而相同pH時(shí)，500 MPa高壓處理使大米蛋白的溶解性增加更顯著，這可能是高壓改變了蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者某些類(lèi)型共價(jià)鍵(如－S－S－)的存在狀態(tài)，從而改善蛋白質(zhì)的溶解性。

進(jìn)一步對(duì)－SH含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，以單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)為基數(shù)，不同處理樣品的可溶性蛋白－SH含量差別不大，說(shuō)明－SH狀態(tài)可能是影響大米蛋白溶解性的必要條件。

表1 不同pH和壓力下蛋白的溶解性/%

2．2 可溶性組分的凝膠色譜分析

利用Sephadex G－100凝膠色譜對(duì)pH 8．0時(shí)500 MPa高壓和非高壓(即0．1 MPa常壓)處理樣品的可溶性組分進(jìn)行了分析(圖1)，可以看出，常壓時(shí)可溶性組分出現(xiàn)2個(gè)峰(峰1和2)，保留時(shí)間分別為80 min和215 min，而高壓處理樣品分離出3個(gè)峰(峰Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)，保留時(shí)間分別為80、200和265 min。峰Ⅰ與峰1保留時(shí)間相同，峰Ⅱ的保留時(shí)間則小于峰2，這表明高壓處理后有較大分子的蛋白質(zhì)溶出，而峰Ⅲ比峰2的保留時(shí)間更長(zhǎng)，說(shuō)明高壓使常壓下可溶的部分蛋白質(zhì)分子變得更小，也許這些蛋白分子發(fā)生了降解或二硫鍵的斷裂。

圖1 pH 8．0下常壓和500 MPa處理蛋白樣品凝膠色譜

為了進(jìn)一步探討可溶性成分的分子特征，測(cè)定了上述不同洗脫峰組分的紫外掃描吸收曲線(圖2)。結(jié)果表明，常壓處理樣品的峰1和峰2有明顯的差別，前者只在204 nm處有較強(qiáng)的光吸收，后者在214 nm和270 nm處光吸收較強(qiáng);而500 MPa處理樣品的峰Ⅰ和峰Ⅱ均在240 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的光吸收性，且二者吸收曲線形狀相近，但與常壓處理的樣品有顯著差異。這意味著500 MPa處理所溶出的蛋白質(zhì)組分與常壓時(shí)的溶出組分具有不同的分子組成和結(jié)構(gòu)特征。

圖2 不同處理樣品洗脫組分的紫外吸收曲線

2．3 可溶性蛋白和不溶性蛋白結(jié)構(gòu)的分析

為了進(jìn)一步探討高壓處理對(duì)熱變性大米蛋白亞基結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)不同高壓處理后可溶性部分和不溶性部分樣品進(jìn)行了SDS－PAGE分析(圖3)。

圖3 不同高壓處理樣品SDS－PAGE圖譜

可以看出，不同高壓處理所得可溶部分具有相近的亞基，包括主要的14、35 ku和少量的22 ku組分;不溶部分樣品也具有相近的亞基組分，包括12、14、35、110 ku主要亞基和少量的22、26 ku亞基，這與未經(jīng)高溫作用大米蛋白的亞基組成相近［16］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大米中主要有13 ku的醇溶蛋白、22、37～39、57 ku的谷蛋白和少量10～200 ku的清蛋白、球蛋白［15］。熱變性米蛋白實(shí)際上是這幾種蛋白質(zhì)的混合體。上述現(xiàn)象表明，高壓處理并沒(méi)有破壞大米蛋白的亞基結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的溶解性與其分子質(zhì)量大小沒(méi)有直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這與圖1凝膠色譜分析的結(jié)果有相似之處。需要說(shuō)明的是，本試驗(yàn)曾對(duì)溶解性蛋白樣品進(jìn)行了多次PAGE分析，但均出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，其原因可能是PAGE中蛋白質(zhì)分子大小和帶電荷量均影響電泳速度，還可能與大米蛋白是糖蛋白有一定關(guān)系［6］。另外，水不溶性蛋白樣品在電泳時(shí)用樣品溶解液(含巰基乙醇、SDS等)也只能使部分蛋白質(zhì)溶解?？傊?，對(duì)高壓處理后可溶及仍不溶大米蛋白組分和結(jié)構(gòu)特征有待于進(jìn)一步深入研究。

2．4 掃描電鏡圖譜分析(SEM)

SEM可以觀察了解蛋白質(zhì)樣品的表面結(jié)構(gòu)，有助于對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。本試驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)樣品的SEM觀察結(jié)果(圖4)顯示:高壓處理可以改變大米蛋白樣品的表面結(jié)構(gòu)。未經(jīng)高壓處理的樣品表面較平滑，結(jié)構(gòu)緊密，外觀呈片層狀，500 MPa高壓處理后的蛋白樣品表面膨松，呈蜂窩狀。高壓改善大米蛋白的溶解性能以及溶解的蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)特征(圖2)可能與高壓處理后蛋白質(zhì)的這種結(jié)構(gòu)變化有很大關(guān)系。

圖4 常壓和500 MPa處理大米蛋白掃描電鏡圖譜

3 結(jié)論

3．1 高壓可以改善大米蛋白的溶解性能。不同pH條件下，高壓處理均表現(xiàn)出明顯的效果。高壓處理對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)或存在狀態(tài)的改變是增加其溶解性能的重要基礎(chǔ)。

3．2 與未高壓處理者相比，大米蛋白經(jīng)高壓處理后可使較大的蛋白質(zhì)分子溶出，也產(chǎn)生了更小的蛋白質(zhì)分子，但SDS－PAGE分析顯示，高壓對(duì)大米蛋白的亞基結(jié)構(gòu)沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響，二者之間的確切關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of High－Pressure on the Solubility and Molecular Character of Rice Protein

Wang Zhangcun Cui Shengwen Tian Weihuan Zhao Xuewei Zheng Jianqiang Li Changwen Yuan Daoqiang
(School of Food＆Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002)

The effect of High Hydrostatic Pressure(HHP)processing on the solubility and molecular character of thermo－denatured rice protein was studied by Sephadex G－100 chromatography，Sodium Dodecyl Sulfate Polyacylamide Gel Electrophoresis(SDS－PAGE)and Scanning Electron Microscope(SEM)．The results showed that after treated by HHP，The ratio of soluble rice protein was increased from12．03%(at 0．1 MPa，pH 8．0)to 19．15%(after 500 MPa for 30 min，pH 8．0)and from 16．60%(at 0．1 MPa，pH 10．0)to 24．87%(after 500 MPa for 30 min，pH 10．0)receptivity;The surface of rice protein particles became loosen，the bigger molecule of the protein was dissolved in the solution and smaller molecular protein was produced，compared with that of not HHPtreated protein．The solubility rice protein produced by different pH and HHPprocessing contained 14，35 and 22 ku subunits，but the insolubility rice protein，in addition to these subunits，contained 12，16 and 110 ku subunits also．

rice protein，high pressure，solubility，molecular characterization

TS209

A

1003－0174(2012)06－0001－04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31071517)

2011－08－19

王章存，男，1963年出生，博士，教授，糧油蛋白質(zhì)深加工