呂 飛，鐘偉龍，朱事康，吳云普，周 宇，曹維強(qiáng)，余優(yōu)軍

（惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 惠州516006）

黃曲霉毒素 M1（AFTM1）是黃曲霉毒素B1的4－羥基衍生物，是AFTB1在體內(nèi)經(jīng)過(guò)羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物［1－2］，一部分從尿和乳汁排出，另一部分存在于動(dòng)物的可食部分中。主要存在于土壤、動(dòng)植物、霉變谷物、各種堅(jiān)果、食品、調(diào)味品、食用油、牛奶和奶制品等霉變制品中［3］，直接或間接進(jìn)入人類(lèi)食物鏈，是致癌致畸致突變的毒物，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命安全。目前，測(cè)定的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、質(zhì)譜法和放射免疫測(cè)定法。常見(jiàn)的檢測(cè)基質(zhì)有糧油、奶制品、動(dòng)物性食品、飼料、真菌和花生制品。但對(duì)豬尿的直接檢測(cè)還未見(jiàn)有相關(guān)的檢測(cè)方法。本文選擇尿液作為檢測(cè)基質(zhì)主要是考慮取樣簡(jiǎn)便和成本低廉。

目前世界各國(guó)對(duì)黃曲霉毒素M1的限量標(biāo)準(zhǔn)意見(jiàn)不統(tǒng)一。歐盟提出乳中黃曲霉毒素M1的限量為0.05μg／kg；美國(guó)、日本等國(guó)提出的限量為 0.5 μg／kg［4］。我國(guó)也只是在相關(guān)嬰幼兒的產(chǎn)品中做了一些限量標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1），對(duì)包括豬尿樣在內(nèi)的其他樣品均未涉及限量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 豬尿（實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品）；黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95.0%，CNS：6795－23－9）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）德國(guó)Meker公司；水為GB／T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備 AB 3200QTRap液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配Agilent1200型液相色譜儀 恒信業(yè)（香港）有限公司；MS2振蕩器、Waters固相萃取裝置廣州市華粵行儀器有限公司；免疫親和層析柱Agela Technologies；0.22μm有機(jī)相濾膜 廣州振祥有限公司。

表1 我國(guó)規(guī)定食品中黃曲霉毒素M1最大限量值 （μg／kg）

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋并定容至10mL棕色容量瓶中，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為10.0mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于－20℃冰箱保存。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.08、0.10、0.50μg／L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，標(biāo)準(zhǔn)使用液使用前配制。以組分的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。外標(biāo)法定量。

1.3.2 分離條件［5］（1）液相色譜分離條件：色譜柱為 Aglient XDB－C18（50mm×4.6mm，1.8 μm）；流速為0.3mL／min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為35℃。流動(dòng)相為A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈＋甲醇（1＋1）；梯度洗脫（見(jiàn)表2）。（2）質(zhì)譜參考條件及檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），詳見(jiàn)表3中母離子、子離子和碰撞能量。

表2 液相色譜梯度洗脫條件

表3 離子選擇參數(shù)表

1.3.3 樣品處理 （1）提?。簻?zhǔn)確量取5.0mL（精確到0.01mL）豬尿樣置于50mL離心管中，用超純水定容到50mL，旋渦混合1min，待凈化。（2）凈化：將一次性的50mL注射器筒與親和柱串聯(lián)，再將親和柱與固相萃取裝置連接起來(lái)。將待凈化液倒入50mL的注射器筒內(nèi)，去掉親和柱下方堵頭，調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，使液體以每秒1滴的速度流出，待液體排干后，更換新的50mL的注射器筒，用10mL水溶液洗滌1次，流速為每秒2滴，待液體排干后，更換新的注射器筒，用1mL甲醇洗脫，流速為每秒1滴，洗脫液過(guò)0.22μm 濾膜后上LC－MS／MS檢測(cè)。（3）樣品測(cè)定：取供上機(jī)檢測(cè)的樣品溶液10μL注入儀器中。根據(jù)樣液中黃曲霉毒素M1含量的情況，選取相應(yīng)值相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測(cè)樣液中黃曲霉毒素M1含量的相應(yīng)值均應(yīng)在儀器的線性范圍內(nèi)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。與標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間比較定性，外標(biāo)法定量。在1.3.2節(jié)分離條件下，黃曲霉毒素 M1的參考保留時(shí)間為2.32min左右。

2 結(jié)果與分析［6－11］

2.1 樣品的預(yù)處理

2.1.1 提取溶劑的選擇 因?yàn)槟谭壑悬S曲霉毒素M1用超純水溶解進(jìn)行檢測(cè)，也考慮用水對(duì)豬尿進(jìn)行稀釋過(guò)免疫親和柱，進(jìn)行添加回收率的試驗(yàn)結(jié)果較好，所以采用水作為提取溶劑。

2.1.2 洗脫液的選擇 因?yàn)辄S曲霉毒素M1易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑中，而且標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制選用了甲醇，所以用甲醇作為洗脫液，試驗(yàn)結(jié)果也同時(shí)表明可以用甲醇做洗脫液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品加標(biāo)色譜圖 按照以上的測(cè)定方法得到黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，樣品空白色譜圖和樣品加標(biāo)（0.10μg／L）色譜圖（圖1～3）。

2.3 方法的線性關(guān)系 黃曲霉毒素 M1在0.01 μg／L～0.50μg／L內(nèi)線性關(guān)系顯著，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.4 最低檢測(cè)限 黃曲霉毒素M1的最低檢測(cè)限為0.01μg／kg。

2.5 方法的加標(biāo)回收率 由表4可見(jiàn)，在添加濃度在0.01～0.10μg／kg范圍內(nèi)，回收率在74.5%～94.0%之間，RSD在2.32%～3.90%之間，樣品的回收效果較好。

表4 樣品加標(biāo)平均回收率 （n＝6）

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)旨在建立豬尿中黃曲霉毒素M1的LC－MS／MS檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)豬尿中黃曲霉毒素M1的快速檢測(cè)。此法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，樣品處理簡(jiǎn)便易行，適用于測(cè)定豬尿中黃曲霉毒素 M1。

［1］朱聰英，應(yīng)永飛，韋敏玨，等.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素的研究［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2010，31（4）：240－246.

［2］張宗城.乳與乳制品中黃曲霉毒素M1的限量確定及測(cè)定方法［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2010，6：36－39.

［3］馬君剛，岳琳，楊文菊.食品中黃曲霉毒素M1污染狀況［J］.新疆畜牧業(yè)，2009，2：51－52.

［4］蘇福榮，王松雪，孫輝，等.國(guó)內(nèi)外糧食中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)制定的現(xiàn)狀與分析［J］.糧油食品科技，2007，6（15）：57－59.

［5］GB 5413.37－2010.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定［S］.

［6］寇琳娜，王浩.液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定植物油中的黃曲霉毒素［J］.油脂工程·技術(shù)，2010，3：15－16.

［7］蔡增軒，潘紅鋒，王麗麗，等.應(yīng)用超高壓液相－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定花生及其制品中的6種黃曲霉毒素［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19（5）：970－974.

［8］鄭燕，王遠(yuǎn)興，李瑾瑾.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中的黃曲霉毒素［J］.食品科學(xué)，2010，31（24）：385－388.

［9］郭 衛(wèi)，韓小賢，何義萍，等.LC／MS法測(cè)定糧油食品中黃曲霉毒素 B1［J］.糧食工程·技術(shù)，2010，8：69－70.

［10］楊靜，哈益明，王鋒.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)花生中的黃曲霉毒素B1［J］.分析試驗(yàn)室，2009，28（6）：35－37.

［11］林建忠，鄒偉，張志剛，等.LC／MS／MS測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1的研究［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14（增刊）：31－32.