吳 荻，魏征人，陳智嘉，劉玉俠，宋光子，高宇航，趙大瑋

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內科，吉林 長春130012；2.吉林大學白求恩醫(yī)學院 藥理學教研室，吉林 長春130021；3.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012）

鹿茸（Cornu Cervi Pantotrichum）為梅花鹿（Cervus nippon）或馬鹿（cervus elaphus）的雄鹿末骨化密生絨毛的幼角，為我國名貴的傳統(tǒng)中藥材，鹿茸蛋白（pilose antler protein，PAP）是從鹿茸中提取的一類具多種生理活性的物質，占鹿茸總質量的52%以上［1－3］，近年來一系列相關的研究發(fā)現(xiàn)鹿茸蛋白具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗疲勞、治療神經損傷等多種生物學效應［4，5］，有廣泛的應用前景和巨大的藥用價值［6］。為進一步研究鹿茸蛋白可能存在的抗腫瘤活性，本課題組特選人肝癌SMMC－7721細胞及人肺腺上皮SPC－A－1細胞進行細胞毒性實驗研究，為鹿茸蛋白的抗腫瘤應用及其作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與主要儀器 雙陽梅花鹿鹿茸購自吉林雙陽梅花鹿養(yǎng)殖基地；超濾離心管（Millipore公司，美國）；透析袋（北京華美生科生物技術有限公司）；SMMC－7721細胞、人肺腺上皮 SPC－A－1細胞（吉林省腫瘤防治研究所保存并提供）；測定蛋白濃度的Folin－酚試劑盒和刀豆蛋白A（Con A）（長春鼎國公司）；5－氟尿嘧啶（5－FU）和順鉑 （DDP）（云南個舊生物制藥有限公司，批號：101203）；其余試劑皆為國產分析純試劑；酶標儀 （Lab Systerm Dragon.Multiskan MK3）。

1.2 鹿茸蛋白組分的提取 稱取新鮮梅花鹿鹿茸900g，橫向切成厚度約為3mm圓形薄片，用超純水沖洗至無血色為止。加入0.01MPBS溶液1 500 ml，用高速組織勻漿機粉碎勻漿，再將勻漿液在4℃條件下，以8 000rpm／min離心15min，取上清液，用截留分子量8000的透析袋以超純水透析，每12h換一次透析液，36h后，將透析袋內液體取出，用截留分子量30 000和10 000的超濾離心管進行分子量截留，4℃條件下，以8 000rpm／min離心15min，離心后，分別取超濾膜兩側的液體，獲取3種不同分子量的鹿茸蛋白組分，0.22μm的微孔濾膜過濾除菌。然后用Folin－酚試劑法測蛋白濃度，用5倍倍比稀釋法構成5個相關濃度的稀釋液，保存在－70℃中待用。

1.3 鹿茸蛋白組分的細胞毒性實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng) SMMC－7721細胞及人肺腺上皮SPC－A－1細胞培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基（10%胎牛血清，5%二氧化碳，37℃），常規(guī)復蘇后培養(yǎng)5天后，第一次傳代，以后每3天傳代一次，取長至對數(shù)生長期的細胞計數(shù)后種板，進行后續(xù)實驗。

1.3.2 MTT檢測 取對數(shù)生長期細胞消化，制備5×104／ml細胞懸液，接種于96孔板 ，每孔加細胞懸液180μl。培養(yǎng)24h后，進行實驗分組及加樣（不同分子量蛋白組分樣品按5倍濃度做倍比稀釋，各濃度做4復孔），用5－FU（25，50，100μg／ml）和DDP（10，20，40μg／ml）做陽性對照。然后進行孵育24h后的MTT檢測。每孔加20μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液，加 DMSO 200μl／孔，震蕩器上震蕩使充分溶解。在酶標儀490nm波長處讀取A值，求出平均值，抑制率（IR）＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。IR＜30%為不敏感，IR≥30%為低度敏感，IR≥50%為中度敏感，IR≥70%為高度敏感［8］。

1.4 鹿茸蛋白組分的淋巴細胞轉化實驗

將昆明小鼠分為：鹿茸蛋白高，中，低3濃度組（鹿茸蛋白原濃度的1／2，1／4，1／8）；胸腺肽陽性對照組（濃度1mg／ml）；生理鹽水陰性對照組；給藥劑量0.01ml／g。經皮下注射14天后，每組各取5只斷頸處死后，經75%乙醇消毒后，放置超凈臺中。

無菌取出脾臟，將其裹入2層無菌紗布中，放置35mm細胞培養(yǎng)皿中，用彎頭鑷子輕輕擠壓脾臟，將脾細胞游離出來。用2ml的RPMI1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）稀釋成脾細胞懸液。緩慢的滴入2ml淋巴細胞分離液的上方。2 000rpm 20 min，離心后，清晰可見細胞分層（共4層）。用吸管輕輕吸出乳白色層（第二層）。置入1.5ml無菌EP管中，2 000rpm，5min。棄去上清液，加入1ml的D－h(huán)anks液。2 000rpm，5min（洗3次），棄洗液，加入RPMI1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）。每組管取0.02ml加到細胞計數(shù)板上，并調至細胞終濃度約為2×106。將10%小牛血清的培養(yǎng)基（含ConA0.005mg／ml）加入96孔無菌細胞板中，每孔0.05ml，再加入脾細胞懸液0.05ml（每組設三個復孔），并設置培養(yǎng)基（不含脾細胞懸液）的空白對照孔。培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中（37°5%CO2）培養(yǎng)72h。

培養(yǎng)終止前2h。取出培養(yǎng)板，每孔依次加入MTT（5mg／ml）0.01ml。加完后輕輕搕板，使之與細胞充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液，并加入DMSO 0.1ml。將顆粒溶解，并終止培養(yǎng)。通過酶標儀570nm檢測OD值。將實驗組和對照組的三復孔OD值平均，轉化值＝實驗組平均OD值－陰性對照組平均OD值。

1.3.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0處理。5－FU、順鉑及鹿茸多肽蛋白對于腫瘤細胞的抑制率數(shù)值比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 鹿茸各蛋白組分的濃度測定 根據(jù)標準曲線得公式y(tǒng)＝0.0082x＋0.3066，F(xiàn)olin－酚試劑盒測得各蛋白組分的濃度值如下：分子量＜10kD：A：0.347，蛋白濃度：4.93μg／ml；分子量＞10kD＜30 kD：A：0.335，蛋白濃度：3.46μg／ml；分子量＞30kD：A：0.483，蛋白濃度：21.51μg／ml。因蛋白濃度測前已稀釋20倍，故分子量＜10kD蛋白組分的原濃度為98.6μg／ml，倍比稀釋濃度由高到低依次為19.72μg／ml，3.94μg／ml，0.79μg／ml，0.16μg／ml。分子量＞10kD＜30kD蛋白組分的原濃度為69.20μg／ml，倍比稀釋濃度依次為13.84μg／ml，2.77μg／ml，0.55μg／ml，0.11μg／ml。分子量＞30 kD蛋白組分的原濃度為430.20μg／ml，倍比稀釋濃度依次為86.04μg／ml，17.21μg／ml，3.44μg／ml，0.69μg／ml。

2.2 鹿茸各蛋白組分的細胞毒性實驗結果 鹿茸各蛋白組分針對SPC－A－1細胞的 MTT實驗結果，經計算得出的細胞生長抑制率見表1。從表1中，SPC－A－1細胞對鹿茸各組分蛋白不敏感，呈現(xiàn)“耐藥”現(xiàn)象，和陽性對照組相比有明顯的差異（P＜0.05）。

表1 鹿茸各蛋白組分針對SPC－A－1的細胞生長抑制率（%）

鹿茸各蛋白組分針對SMMC－7221細胞的MTT實驗結果，經計算得出的細胞生長抑制率見表2。從表2中，分子量＜10kD，＞30kD，10～30 kD的鹿茸蛋白組分中，高劑量組的抑制率均大于30%，呈現(xiàn)“低度敏感”；分子量＜10kD，10～30kD的鹿茸蛋白組分中，中高劑量組的抑制率大于30%，呈現(xiàn)“低度敏感”。而且呈現(xiàn)劑量依賴性關系。

表2 鹿茸各蛋白組分針對SMMC－7221的細胞生長抑制率（%）

2.3 鹿茸蛋白組分的淋巴細胞轉化實驗結果 鹿茸蛋白組分高、中、低劑量組的平均OD值分別為為0.46±0.05、0.29±0.03和0.17±0.03；胸腺肽陽性對照組的平均OD值為0.47±0.07；生理鹽水陰性對照組的平均OD值為0.12±0.04。鹿茸蛋白組分高、中、低劑量組的轉化值分別為0.34、0.17和0.05；胸腺肽陽性對照組的轉化值為0.35。鹿茸蛋白組分的高中劑量組和胸腺肽對照組與陰性對照組OD值比較，差異具有顯著性（P＜0.05）；鹿茸蛋白組分的高劑量組和胸腺肽對照組OD值比較，差異不具有顯著性（P＞0.05）。

3 討論

吉林省長春市雙陽區(qū)有300多年養(yǎng)鹿歷史，此地區(qū)養(yǎng)殖的梅花鹿是我國特有的梅花鹿品種，而鹿茸蛋白具有促生長、抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤等多種生物學活性。本實驗采用了超濾離心法是目前很流行的一種根據(jù)分子量不同的蛋白質組分分離方法［9］，其具有分離速度快，操作簡便，獲取的分子量范圍比較準確、不喪失蛋白活性、具有濃縮效應等諸多優(yōu)點，便于今后鹿茸蛋白組分的分級分離中大規(guī)模應用。

本課題組曾就鹿茸蛋白應用安全性問題進行過初步的研究［10］，發(fā)現(xiàn)鹿茸總蛋白經過口服、皮下、腹腔注射等給藥途徑，對小鼠組織器官有一定的病理性損傷，但不知這種損傷是否和其細胞毒性有關。進一步實驗采用了MTT法，旨在探討鹿茸蛋白對于所選取的人肝癌SMMC－7721細胞系和人肺腺癌SPC－A－1細胞系是否有明確的細胞毒性作用，陽性對照是5－FU 及順鉑，［11，12］實驗結果顯示：SMMC－7721和SPC－A－1對5－FU 敏感性較高，SPC－A－1對鹿茸各組分蛋白不敏感，不同分子量的鹿茸蛋白組分組間比較，細胞毒性無統(tǒng)計學差別（P＞0.05）；而SMMC－7721細胞對順鉑及鹿茸蛋白低度敏感，說明鹿茸各分子量蛋白組分有輕微抑制SMMC－7721細胞生長的作用，與順鉑作用相似，而且抑制作用與濃度呈正相關，雖然這種細胞毒性與5－FU相比有明顯的差異（P＜0.05），但因其抑制率超過30%，說明了鹿茸蛋白組分具有輕度抑制腫瘤生長的作用。可進一步進行信號傳導通路方面的研究，明確其作用機制。

另外，本研究還探討了鹿茸蛋白組分促進淋巴細胞轉化增殖活性，研究結果顯示：鹿茸蛋白組分均具有明確的促進淋巴細胞轉化功能，其中，高劑量組與胸腺肽陽性對照組具有相似的促進淋巴細胞轉化活性，兩者沒有明顯的差異（P＞0.05）。提示鹿茸蛋白組分的抗腫瘤作用可能還有免疫學途徑的參與，值得進一步研究。

［1］佟 鑫，劉玉俠，吳 荻，等.鹿茸多肽組分藥理作用的研究進展［J］.中國醫(yī)藥技術經濟與管理，2009，3（4）：60.

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