王愛(ài)軍 馮俊偉 劉 萱 王紅鈺 高 宏 鄭寶軍 施 華

(唐山市工人醫(yī)院腫瘤外科，河北 唐山 063000)

二氫青蒿素體外抑制胃癌細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲

王愛(ài)軍 馮俊偉 劉 萱1王紅鈺 高 宏2鄭寶軍 施 華

(唐山市工人醫(yī)院腫瘤外科，河北 唐山 063000)

目的 探討二氫青蒿素(DHA)對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞體外黏附、遷移和侵襲的影響及其可能機(jī)制。方法 1.25、2.5、5、10、20 μmol/L DHA作用體外培養(yǎng)的人胃癌SGC7901細(xì)胞24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;1.25、2.5、5 μmol/L DHA作用人胃癌SGC7901細(xì)胞24 h后，細(xì)胞黏附分析檢測(cè)細(xì)胞黏附率;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響;RT-PCR和Western印跡分別檢測(cè)ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組相比，1.25、2.5、5 μmol/L DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，但顯著抑制SGC7901細(xì)胞黏附、遷移和侵襲能力，且抑制作用具有劑量依賴(lài)性。RT-PCR和Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5 μmol/L DHA作用人胃癌SGC7901細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)ICAM-1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，TIMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。結(jié)論 DHA可體外抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與上調(diào)TIMP-2的表達(dá)，下調(diào)ICAM-1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

二氫青蒿素;胃癌;黏附;遷移;侵襲

胃癌是常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一，術(shù)后肝、肺、骨等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。侵襲、轉(zhuǎn)移行為是惡性腫瘤的本質(zhì)特性，也是腫瘤患者治療失敗和致死的主要原因，因此，抑制腫瘤侵襲成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)〔1〕。二氫青蒿素(DHA)為青蒿素類(lèi)藥物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物。已經(jīng)證實(shí)，DHA具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，但目前尚未見(jiàn)到DHA抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的報(bào)道。因此，本研究將DHA作用于體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株SGC7901，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并從分子水平上初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人SGC7901購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)(37℃，5%CO2)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每3～4 d傳代1次。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 DHA(批號(hào)：100184-200402)購(gòu)于中國(guó)生物藥品檢定所。DHA用二甲基亞砜(DMSO)配成濃度為100 mmol/L的儲(chǔ)液，-70℃保存。作用于細(xì)胞時(shí)再用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成不同終濃度(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)。以含 0.1%DMSO的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組，共分為6組。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO購(gòu)自Sigma公司;Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司;Transwell侵襲小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司;細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP抑制劑(TIMP)-2和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)PCR由上海生工生物技術(shù)公司合成;ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2、β-actin 一抗購(gòu)自Santa Cruz公司。引物序列如下：ICAM-1上游：5'-TGTCTACTGACCCCAACCCTTGATG-3'，下游：5'-GCAAGCTCCCAGTGAAATGCAAAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 498 bp。MMP-2 上游：5'-TCTCCTGACATTGACCTTGGC-3'，下 游：5'-AGGGTGCTGGCTGAGTAGAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 300 bp。MMP-9 上游：5'-TCTACACCCAGGACGGCAAT-3'，下游：5'-CGCCACGAGGAACAAACT GT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 370 bp。TIMP-2上游：5'-CTGGACGTTGGAGGAAAGAAGG-3'，下游：5'-GCTGTTTCCAGGAAGGGATGTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 450 bp。β-actin上游5'-CAGGGTGTGATGGTGGG-3'，下游 5'-GGAAGAGGATGCGGCAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度500 bp。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖分析 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞分為對(duì)照組和 DHA 組，DHA 組加入含不同濃度(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)DHA的培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等量的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。孵育20 h，各孔中加入MTT(濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，室溫振蕩15 min。酶標(biāo)儀490 nm測(cè) OD值，求出其平均值。增殖率(%)=DHA組平均OD值/對(duì)照組平均OD值×100%。

1.2.2 細(xì)胞黏附分析 將1.25、2.5、5 μmol/L DHA處理24 h的SGC7901細(xì)胞消化離心后，按5×104個(gè)/孔的密度將細(xì)胞加入Matrigel包被好的96孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)1 h后，棄去未黏附的細(xì)胞，加入100 μl RMPI 1640培養(yǎng)基和20 μl MTT(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩15 min。酶標(biāo)儀490 nm測(cè)OD值。細(xì)胞黏附率(%)=DHA組平均OD值/對(duì)照組平均OD值×100%。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞制成懸液，以1×106個(gè)/ml的密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至100%匯合后，吸去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，用無(wú)菌吸頭沿培養(yǎng)板底部劃一直線(xiàn)形劃痕。PBS再次洗去被刮下的未貼壁細(xì)胞，DHA組加入含1.25、2.5、5 μmol/L DHA 的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量的0.1%DMSO培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞傷口愈合情況。任意取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)越過(guò)劃線(xiàn)生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)。抑制率(%)=(1-DHA組遷移細(xì)胞的數(shù)量/對(duì)照組遷移細(xì)胞的數(shù)量)×100%。

1.2.4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將 1.25、2.5、5 μmol/L DHA作用24 h的SGC7901細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整濃度為2×105個(gè)/ml，各組分別吸取200 μl接種于上層小室，將小室置于24孔板，下室加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦掉上室面的Matrigel和細(xì)胞，膜用甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色，高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。抑制率(%)=(1-DHA組侵襲細(xì)胞的數(shù)量/對(duì)照組侵襲細(xì)胞的數(shù)量)×100%。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè) ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA的表達(dá) 收集5 μmol/L DHA作用24 h的SGC7901細(xì)胞，采用Trizol一步法從細(xì)胞中提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA濃度及純度。各組取等量RNA反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)條件為96℃ 4 min 預(yù)變性，95℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。用各目的基因片段密度值/內(nèi)參照密度值的比值進(jìn)行比較。

1.2.6 Western 印跡分析 ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2 蛋白的表達(dá) 收集5 μmol/L DHA作用24 h的SGC7901細(xì)胞，冷的PBS清洗后，加入冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃，離心取上清定量后，每孔上樣蛋白(50 μg)，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺分離，轉(zhuǎn)移到氟偏聚丙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用各目標(biāo)分子特異性一抗4℃孵育過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min，加相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光法顯色，對(duì)條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。目的基因蛋白表達(dá)量以各目的蛋白條帶吸光度值/內(nèi)參照β-actin吸光度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以±s表示，采用ANOVA分析處理和Dunnett檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DHA對(duì) SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用 10、20 μmol/L DHA均能抑制SGC7901細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)。而 1.25、2.5、5 μmol/L DHA 作用SGC7901細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯的抑制作用(P＞0.05)。為排除DHA對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲的作用受到細(xì)胞的活力的影響，后續(xù)實(shí) 驗(yàn)條件均采用 1.25、2.5、5 μmol/L DHA 作用SGC7901細(xì)胞24 h。見(jiàn)表1。

表1 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖率的影響(n=6±s)

表1 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖率的影響(n=6±s)

與0 μmol/L(對(duì)照)組比較：1)P ＜0.05;下表同

濃度(μmol/L) OD值 增殖率(%)0 0.759±0.124 -1.25 0.752±0.132 99.1 2.5 0.703±0.121 92.6 5 0.694±0.135 91.4 10 0.606±0.1051) 79.8 20 0.591±0.0961)77.9

2.2 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞黏附的影響 1.25、2.5、5 μmol/L DHA作用SGC7901細(xì)胞24 h，隨著DHA濃度的增加，細(xì)胞黏附率逐漸下降，呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，分別為(81.6±12.3)%、(65.3±10.5)%、(46.8±8.6)%。

2.3 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1.25、2.5、5 μmol/L DHA 對(duì) SGC7901 細(xì)胞的遷移均有抑制作用，遷移抑制率分別為(26.1±4.8)%、(39.8±6.5)%和(50.5±8.3)%。

2.4 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞黏附、遷移和侵襲相關(guān)分子表達(dá)的影響 RT-PCR和Western印跡分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5 μmol/L DHA 作用 SGC7901細(xì)胞 24 h，細(xì)胞內(nèi) ICAM-1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，TIMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)。見(jiàn)表2，表3，圖1，圖2。

圖2 DHA對(duì) SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá)的影響

表2 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響(n=6±s)

表2 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響(n=6±s)

組別ICAM-1 MMP-2 MMP-9 TIMP-2對(duì)照組0.73±0.25 0.66±0.18 0.57±0.13 0.24±0.05 DHA組 0.26±0.061) 0.33±0.081) 0.18±0.041) 0.53±0.121)

2.5 DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞侵襲的影響 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度(1.25、2.5、5 μmol/L)DHA 作用SGC7901細(xì)胞24 h，細(xì)胞的侵襲能力隨著作用濃度逐漸下降，侵襲抑制率分別為(13.2±3.1)%、(19.9±4.9)%、(27.6±5.6)%。

表3 DHA 對(duì) SGC7901 細(xì)胞 ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá)的影響(n=6±s)

表3 DHA 對(duì) SGC7901 細(xì)胞 ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá)的影響(n=6±s)

組別ICAM-1 MMP-2 MMP-9 TIMP-2對(duì)照組0.68±0.17 0.85±0.27 0.76±0.24 0.29±0.04 DHA組 0.34±0.051) 0.47±0.091) 0.23±0.031) 0.56±0.091)

3 討論

青蒿素(artemisinin)及其衍生物是我國(guó)科學(xué)家自主研制的一類(lèi)傳統(tǒng)抗瘧藥，DHA是青蒿素的重要衍生物之一，其分子式為C15H24O5，分子量為284.35，水溶性強(qiáng)、口服利用度高。隨著對(duì)DHA研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除了高效的抗瘧作用外，DHA還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗癌等生物學(xué)功能〔2～4〕，不僅如此，其抗腫瘤活性強(qiáng)，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但作用機(jī)制還不完全明了。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的復(fù)雜過(guò)程，從分子水平可概括為黏附、蛋白降解和移動(dòng)三個(gè)步驟，這三個(gè)步驟不斷連續(xù)反復(fù)進(jìn)行，臨床上表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此，阻止任何一個(gè)步驟，都可以發(fā)揮抑制腫瘤遷移和侵襲的作用。本研究首先通過(guò)MTT分析，選用對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響的1.25、2.5、5 μmol/L三個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。黏附是腫瘤細(xì)胞侵襲的始動(dòng)因素，只有腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附后，才能穿透基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步侵襲周?chē)M織。本研究首先通過(guò)黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DHA可劑量依賴(lài)抑制SGC7901細(xì)胞黏附率。ICAM-1是一種跨膜蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的黏附。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組SGC7901細(xì)胞ICAM-1表達(dá)較高，DHA作用后，ICAM-1的表達(dá)呈劑量依賴(lài)性下降。

Matrigel被稱(chēng)為人工基底膜膠，主要由Ⅳ型膠原和層黏連蛋白組成，與基底膜結(jié)構(gòu)非常相似，將Matrigel鋪在Transwell小室膜上，能形成類(lèi)似于天然基底膜的結(jié)構(gòu)，可作為研究腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程很好的體外模型。本文分別通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲能力也隨著DHA濃度的增加逐漸降低。腫瘤要發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲，首先要降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，而MMPs家族是降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白水解酶類(lèi)，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用〔5〕。其中MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成員，是一種依賴(lài)鋅離子的蛋白水解酶。多種腫瘤細(xì)胞都可分泌MMP-2和MMP-9，二者通常以酶原的形式存在，激活后才能將基底膜和ECM中的膠原蛋白降解。MMPs的過(guò)表達(dá)或活性增高與胃癌生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，DHA抑制了MMP-2和MMP-9的表達(dá)。

TIMPs是在體內(nèi)分布廣泛的一個(gè)多基因家族的編碼蛋白，是MMPs的天然抑制劑，可通過(guò)與MMPs非共價(jià)結(jié)合抑制其活性。在負(fù)性調(diào)節(jié)基底膜降解過(guò)程中，TIMPs與MMPs之間存在著微妙的平衡關(guān)系，在胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用〔6〕。如果TIMPs與MMPs之間的平衡被打破，也會(huì)導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)DHA作用SGC7901細(xì)胞后，可顯著上調(diào)TIMP-2的表達(dá)，提示DHA可通過(guò)多種途徑抑制胃癌轉(zhuǎn)移。

圖1 DHA對(duì) SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響

綜上所述，DHA可體外抑制SGC7901細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力;其機(jī)制可能與上調(diào)TIMP-2的表達(dá)，下調(diào)ICAM-1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。然而，由于體外實(shí)驗(yàn)的局限性和體內(nèi)生理環(huán)境的復(fù)雜性，尚需結(jié)合更深入的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)探討DHA對(duì)SGC7901細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，以期為臨床治療胃癌提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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R735.2

A

1005-9202(2012)17-3716-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.047

1 唐山市工人醫(yī)院耳鼻喉科 2 唐山市工人醫(yī)院泌尿外科

王愛(ài)軍(1967-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事普外腫瘤的臨床與基礎(chǔ)研究。

〔2012-01-03收稿 2012-01-13修回〕

(編輯 袁左鳴)