蔡愛群，余明練

(韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

赤芝（Ganoderma lucidum)和松杉靈芝（Ganoderma tsugae）均屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝菌屬。有關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)赤靈芝多糖可減輕動脈粥樣硬化風(fēng)險，降低血脂。鄭克巖等人通過小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠睪丸染色體畸變和Ames試驗觀察了松杉靈芝多糖的抗突變作用[1]。大量實驗證明，靈芝多糖具有提高人體免疫能力、抗癌、抗病毒、護肝、延緩衰老、防止慢性支氣管炎和鎮(zhèn)靜止痛等功效。

由于靈芝多糖的藥用價值高，近年來，靈芝多糖暢銷于東南亞各國、臺灣和香港等地。市場需求量日趨增加，供求關(guān)系緊張。子實體和菌絲體在藥用價值方面相同，由于子實體生產(chǎn)周期長，受氣候影響大，影響產(chǎn)量及質(zhì)量，通過液體培養(yǎng)菌絲體取代人工栽培子實體，大大縮短生產(chǎn)周期，提高靈芝多糖的生產(chǎn)能力。對解決資源匱乏、滿足市場需要、提高經(jīng)濟效益，均具有十分重要的意義。

在靈芝多糖含量研究方法方面近幾年一直都有報道。于浩瀚等[2]對靈芝深層發(fā)酵菌絲體多糖含量的測定，結(jié)果表明以超聲波破壁處理后，再以熱水浸提法提取，多糖得率可以明顯提高。多糖含量的測定方法，前人學(xué)者研究了苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法、3，5－二硝基水楊酸法、Fehling滴定法、碘量法、高效液相色譜法等多種測定方法。趙陽楠[3]等研究了苯酚硫酸法和間接碘量法測定靈芝多糖含量比較，結(jié)果顯示測定總糖的結(jié)果基本一致，均不需要精密儀器，操作簡便，穩(wěn)定可靠。通過前人的研究總結(jié)，多糖含量測定的方法基本成熟，只是在具體實驗操作中可根據(jù)不同的實驗?zāi)康暮蛯嶒灄l件選擇合適的方法。

近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者都集中于研究赤芝和松杉靈芝液體培養(yǎng)營養(yǎng)需求和多糖提取測定的研究。例如，泰山赤靈芝液體培養(yǎng)條件優(yōu)化及多糖含量測定[4]，松杉靈芝發(fā)酵菌絲體中水溶多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)的比較研究[5]。但眾多的研究都是單一地對赤芝或者是松杉靈芝來研究測定，還沒有對它們進行比較探究。本試驗通過在相同的液體培養(yǎng)條件下，對赤芝和松杉靈芝的多糖含量得率進行比較，旨為發(fā)酵培養(yǎng)工廠化研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

赤芝、松杉靈芝菌種：韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑

去皮馬鈴薯、KH2PO4、MgS04·7H2O、瓊脂、葡萄糖、0.1%蒽酮－硫酸、95%乙醇、蒸餾水。

蒽酮試劑：稱取0.1g蒽酮，溶于80%濃硫酸（將98%濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中）100 mL，冷卻至室溫，儲存于棕色瓶內(nèi)，冰箱保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 儀器設(shè)備

三角瓶、紗布、容量瓶、圓底燒瓶、研磨缽、10 mL離心管、超凈工作臺、可調(diào)速旋轉(zhuǎn)式搖床、電子天平、高速離心機、可見光分光光度計，水浴鍋等。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液定容至1 000 mL，加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，0.1 MPa滅菌30 min，擺斜面。（不加瓊脂就是種子液體培養(yǎng)基）。

液體培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基中加KH2PO43 g、MgS04·7H2O 1.5 g（不加瓊脂）

1.2 方法

1.2.1 菌種活化[6]

將保存的赤芝和松杉靈芝菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng) 7 d。

1.2.2 菌絲體液體培養(yǎng)與收集

取約0.5 cm2大小的活化菌種轉(zhuǎn)接于裝有100 mL種子液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每瓶接種3塊～4塊，28℃，150 r·min－1，振蕩培養(yǎng) 6 d。 將大約 10 mL 種子培養(yǎng)液分別接入 100 mL培養(yǎng)基中，28℃，150 r·min－1振蕩培養(yǎng)4 d。用3層紗布將發(fā)酵液過濾，蒸餾水洗滌3次，將菌絲體收集60℃烘干至恒重，研磨成菌粉備用。2種供試菌種均設(shè)2次重復(fù)，每次重復(fù)中赤芝和松杉靈芝各培養(yǎng)5瓶[2,6]。

1.2.3 菌絲體生物量的測定

稱量以上備用菌粉，精確到0.01 g。計算公式[7]：

1.2.4 赤芝和松杉靈芝多糖的提取

分別稱取赤芝和松杉靈芝菌粉約0.3 g，至于圓底燒瓶中加水50 mL沸水浴中浸提2 h，放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一容量瓶，加水至刻度，搖勻，過濾，精密量取濾液2 mL分別裝于3支10 mL離心管中，按1∶4比例每支離心管加95%乙醇8 mL，搖勻，至于冰箱中冷藏過夜。次日取出，4 000 r·min－1離心20 min，棄上清液，沉淀加75%乙醇，洗滌2次，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，作為待測溶液[8]。

1.2.5 赤芝和松杉靈芝多糖含量的測定：蒽酮－硫酸法[3,9]

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水適量使溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 mL置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。即得到濃度為 100 μg·mL－1葡萄糖對照品溶液。

取6支10 mL具塞試管，從0～5編號，按表1分別加入各試劑。

將各管快速搖動混勻后，放在沸水浴中15 min，取出冷卻，在625 nm波長下，用空白調(diào)零測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（C）（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得一不過原點的直線。葡萄糖的濃度在 20 μg·mL－1～100 μg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，見圖1。回歸方程為A=0.0062C+0.0264，r=0.9982。

表1 蒽酮-硫酸法測多糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量及測定結(jié)果

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）赤芝和松杉靈芝待測溶液多糖含量的測定

分別精密吸取1.2.4所得的待測溶液1 mL，置于10 mL具塞試管中，加入5 mL蒽酮試劑，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，依法測定吸光度（A）。由回歸方程計算待測溶液中葡萄糖濃度（C），按照下式計算赤芝和松杉靈芝多糖含量[10]。

式中：W為多糖含量（%）；C為待測溶液中葡萄糖濃度（μg·mL－1）； f為待測溶液稀釋倍數(shù)； V 為樣品定容體積；m為樣品的質(zhì)量（μg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤芝和松杉靈芝液體培養(yǎng)菌絲體生長比較

在重復(fù)Ⅰ和重復(fù)Ⅱ的培養(yǎng)中，從肉眼觀察，赤芝菌絲體生長速度快，松杉靈芝菌絲體生長速度較慢，而且赤芝菌絲球體積比松杉靈芝菌絲球要大。以獲取菌絲體為目標(biāo)則可首選赤芝，其生長速度快但衰老和自溶速度也快，因此要把握其發(fā)酵時間。對液體培養(yǎng)的菌絲體干重進行測定，測定結(jié)果如表2。

表2 赤芝和松杉靈芝菌絲體干重比較

從表2得知，赤芝菌絲體干重平均值為0.640 g·100－1·mL－1，松杉靈芝菌絲體干重平均值為 0.426 g·100－1·mL－1。測定結(jié)果表明，液體培養(yǎng)的菌絲體干重赤芝也比松杉靈芝高。

2.2 赤芝和松杉靈芝多糖含量比較

不同菌株生物活性多糖的含量由于菌種特性、培養(yǎng)條件的不同存在差異[2]。在相同的培養(yǎng)基、相同的培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、時間，對赤芝和松杉靈芝進行液體培養(yǎng)，并用相同的提取方法提取多糖，對它們的菌絲體多糖含量進行測定。測得數(shù)據(jù)如表3、表4。

從表3、表4得知，兩種菌株在兩批的液體培養(yǎng)中，赤芝多糖含量平均值為7.22%，松杉靈芝多糖含量平均值為3.78%。測定結(jié)果表明，赤芝菌絲體多糖含量比松杉靈芝高。

表3 赤芝菌絲體多糖含量

表4松杉靈芝菌絲體多糖含量

綜上所述，本試驗通過在相同的培養(yǎng)條件對赤芝和松杉靈芝，采用蒽酮－硫酸法測定它們的多糖含量，得出的結(jié)果是液體培養(yǎng)的菌絲體生長速度赤芝比松杉靈芝快，多糖含量也比松杉靈芝高，因此赤芝更適合用于液體培養(yǎng)生產(chǎn)靈芝多糖。

3 討論

3.1 培養(yǎng)條件的選擇

在赤芝和松杉靈芝液體培養(yǎng)中選擇最普通的加富PDA培養(yǎng)基，減少了兩種靈芝生長營養(yǎng)成分的差異。由于赤芝生長速度快自溶速度也快，所以要控制好培養(yǎng)時間，要在赤芝未發(fā)生自溶之前就要將兩種靈芝的菌絲體收集。

3.2 提取方法

不同的提取方法對靈芝菌絲體中多糖的提取率不同[8]。本法采用沸水浴提取，提取時間確定為2 h，然后用乙醇醇析過夜，對赤芝和松杉靈芝多糖提取率均屬正常，該法操作簡易，切實可行。今后可研究赤芝和松杉靈芝最佳的提取時間：延長提取時間或者進行多次提?。灰掖即嘉龅臅r間可以根據(jù)試驗的需要，延長或者縮短來達到最好的提取效果。

3.3 測定的方法

多糖含量測定的方法有很多，但是常用的多數(shù)是苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法、間接碘量法等。通過前人學(xué)者的研究，證明測定多糖的方法對多糖含量的影響不大，結(jié)果基本一致。但是如果是操作上的誤差，就會對試驗結(jié)果造成很大影響。由于苯酚容易氧化，見光或遇氧即氧化成淡紅色，對顯色有干擾。間接碘量法中要加硫代硫酸鈉，由于它具不穩(wěn)定性，而且堿容易影響碘揮發(fā)，會使測定產(chǎn)生誤差。蒽酮－硫酸法中蒽酮都會受光和氧的影響對顯色有干擾，蒽酮是溶于硫酸中。苯酚－硫酸法中，是先加苯酚再加硫酸，多次滴加試劑，容易造成劑量的誤差[3]。蒽酮硫酸法使用起來比較方便，涉及的藥品比較少，避免了藥品不穩(wěn)定性產(chǎn)生的誤差，操作容易。

3.4 菌絲體產(chǎn)量的比較

從2.1測定的結(jié)果來看，赤靈菌絲體產(chǎn)量比松杉靈芝高，這可能是菌株自身的生物特征影響著其產(chǎn)量，就從肉眼觀察就可以粗略地判斷赤芝和松杉靈芝菌絲體產(chǎn)量高低，赤芝菌球體體積明顯比松杉靈芝大，而且生長密集，所以以獲取菌絲體為目標(biāo)，優(yōu)先選擇赤芝。

3.5 多糖含量和測定方法比較

從2.2測定的結(jié)果來看，重復(fù)Ⅰ中赤芝和松杉靈芝多糖含量都比重復(fù)Ⅱ高，產(chǎn)生的原因可能是菌絲體開始發(fā)生自溶現(xiàn)象使多糖含量降低，又或者是測定時操作上產(chǎn)生的誤差。從兩次的培養(yǎng)中赤芝多糖含量明顯比松杉靈芝多糖含量要高，因此以生產(chǎn)靈芝多糖為前提，赤芝是優(yōu)先選擇的菌株。試驗結(jié)果看得出赤芝多糖含量比松杉靈芝多糖含量高，產(chǎn)生這結(jié)果的原因有：靈芝菌株特有的生物特性決定了它本身的有效成分的高低，可能是松杉靈芝多糖含量比較低，其它有效成分比較高，分配比例不同；培養(yǎng)條件也影響著結(jié)果，有可能是培養(yǎng)基還沒有達到兩種靈芝的最佳營養(yǎng)需求，如培養(yǎng)溫度、時間還沒有調(diào)節(jié)好，也有可能影響結(jié)果。

3.6 存在問題及解決方法

液體培養(yǎng)時，菌絲體要與空氣充分接觸，進行氧氣交換，用瓶塞由于封閉太密，空氣得不到充分流通，菌絲體生長受到抑制，影響生長速度。為了達到充分氧氣交換，改用8層紗布和2層報紙蓋住三角瓶口。

在試驗的液體培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)赤芝菌絲體生長速度比松杉靈芝快，而且菌絲球體大，很快就長滿三角瓶。此試驗要求在相同的培養(yǎng)條件下，即培養(yǎng)時間也相同，所以選擇收集菌絲體的時間是一個關(guān)鍵，在確保赤芝菌絲體還未發(fā)生自溶的前提下，同一時間收集成熟的松杉靈芝菌絲體。

在烘干過程中，如果時間過長，菌絲體就會發(fā)生自溶影響多糖的含量，因此為了盡快將其烘干，將菌絲體分裝在多個容器里烘干至恒重。

本試驗是采用熱水浸提法提取多糖、蒽酮－硫酸法測定多糖，由于提取的方法會影響多糖含量，所以可以進一步嘗試用其它方法來提取后，再蒽酮－硫酸法測定赤芝和松杉靈芝多糖含量進行比較研究。

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