金 燕 劉光耀 (吉林大學第二醫(yī)院眼科，吉林 長春 3004)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)包括糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變和視網(wǎng)膜神經(jīng)病變。研究表明，糖尿病早期未出現(xiàn)微血管病變之前即出現(xiàn)視網(wǎng)膜的神經(jīng)病變〔1，2〕。慢性高血糖導(dǎo)致的糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的堆積是促進DR發(fā)生及發(fā)展的重要機制〔3〕。本研究體外建立純化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)培養(yǎng)體系，觀察AGEs對純化培養(yǎng)的RGCs細胞半胱氨酸蛋白酶caspase-3活性的影響，探討糖尿病時RGCs的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇出生3 d的Wistar乳鼠用于實驗。

1.2 材料 Neurobasal培養(yǎng)基、B27(美國，Gibco)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維生長因子、層黏連蛋白、多聚鳥氨酸、抗-鼠巨噬細胞抗體(美國，Chemicon)、抗鼠Thy1.1單克隆抗體。

1.3 AGEs及其對照物的制備和檢測 牛血清白蛋白(BSA)50 g/L、D-葡萄糖 0.5 mol/L、磷酸緩沖 液 (PBS，pH7.4)0.01 mol/L，1.5 mmol/L的苯甲基磺酰氟化物和0.5 mmol/L的乙二胺四乙酸，0.22 μm濾膜過濾除菌，37℃孵化42 d。對照液除不含D-葡萄糖外，其他物質(zhì)濃度及配置方法同上。所有AGEs孵化結(jié)束后，采用PBS廣泛透析法將未結(jié)合的葡萄糖除去，調(diào)整葡萄糖濃度至5.5 mmol/L(pH7.2)，4℃冰箱儲存?zhèn)溆?，AGEs的濃度用Bradford法測定。AGEs-BSA對照物的制備除不加葡萄糖外，其他材料及方法同前。

1.4 RGCs純化培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下將乳鼠斷頭處死，解剖顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜，制備RGCs懸液?？故缶奘杉毎贵w(1∶100，PBS稀釋)包被培養(yǎng)瓶，室溫孵育 2 h，4℃過夜，PBS輕洗3次?？故骉hy1.1單克隆抗體(1∶300，PBS稀釋)包被塑料培養(yǎng)管，室溫孵育2 h，4℃過夜，PBS輕洗3次。在包被抗鼠巨噬細胞抗體的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入 RGCs懸液，37℃孵育30 min，吸取未黏附的細胞懸液，置于包被抗鼠Thy1.1單克隆抗體的塑料培養(yǎng)管中，37℃孵育30 min，收集黏附于管壁的RGCs，計數(shù)后進行培養(yǎng)。內(nèi)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，預(yù)先用多聚鳥氨酸室溫包被，加入含B27的Neurobasal培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，用ABC法進行Thy1.1抗體免疫組化鑒定。培養(yǎng)細胞用1 mol/L calcein-AM(Molecular Probes，Eugene，OR)染色，激光共聚焦顯微鏡對熒光染色的細胞照相。

1.5 細胞存活率檢測 采用Live/Dead Cell Viability Kit檢測培養(yǎng)體系中RGCs存活率，檢測活細胞數(shù)/總細胞數(shù)的百分比。

1.6 原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL法)檢測凋亡細胞 分別在實驗組、對照組加入AGEs及其對照250 μg/ml，24 h后4%多聚甲醛固定，按試劑盒說明標記細胞凋亡，顯微鏡下觀察8個高倍視野的陽性細胞數(shù)，將陽性細胞數(shù)占對照組總細胞數(shù)的百分比作為檢測指標。

1.7 caspase-3活性檢測 培養(yǎng)結(jié)束后，各組細胞600 r/min離心5 min，收集細胞棄上清，冰浴裂解后4℃ 16 000 r/min 4℃離心15 min，把上清轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，－70℃保存?zhèn)溆?實驗設(shè)空白對照孔和待測樣品孔，均加入含熒光底物Ac-DEVD-AMC的caspase-3反應(yīng)緩沖液45 ml/孔;空白孔加5 ml/孔正常細胞裂解液(含 cocktail)，待測樣品孔加10 mg/孔(5 ml)細胞總蛋白，總量50 ml/孔。加入樣品后立即使用Polarstar熒光分光光度計檢測AMC釋放量。

2 結(jié)果

2.1 RGCs的培養(yǎng) 純化的RGCs培養(yǎng)3 h后開始貼壁，24 h后細胞開始伸出小的突起，72 h后突起增多并伸長，培養(yǎng)1 w后存活的RGCs數(shù)量開始減少。24 h后，培養(yǎng)體系中細胞存活率為(93.2±7.52)%。AGEs作用下培養(yǎng)24 h的RGCs存活率為(58.17±6.23)%。較對照組細胞存活率明顯降低(P＜0.05)。見圖1。

圖1 兩組培養(yǎng)24 h的RGCs(calcein-AM染色，×200)

2.2 細胞凋亡的檢測 AGEs作用24 h后，(29.2±3.5)%的RGCs發(fā)生凋亡，而正常對照組有(4.8±1.3)%的細胞凋亡，兩者比較有顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 caspase-3活性檢測 AGEs作用下不同時間RGCs細胞caspase-3活性為，0 h：0.97 ± 0.03，8 h：4.12 ± 0.87，16 h：8.65±1.87，24 h：12.31±2.23。較正常對照組 caspase-3 活性明顯增強(P＜0.05)。

3 討論

RGCs的純化培養(yǎng)是本研究的關(guān)鍵步驟。RGCs的體外培養(yǎng)主要分為純化培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，混合培養(yǎng)的RGCs存活率高，但混有其他視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞等，影響對RGCs特性的分析。Immuno-panning方法是目前國際上認可的建立RGCs純化培養(yǎng)體系的可靠方法，采用免疫學方法將純化RGCs分離出來。用無血清的神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，能避免血清中的多種不明成分影響實驗結(jié)果的觀察。采用的培養(yǎng)基添加了B27等神經(jīng)生長因子，B27可以降低培養(yǎng)過程中的氧化損傷，利于細胞生長。利用此方法能得到高純度、活力好的RGCs〔4〕。Calcein-AM是一種綠色熒光細胞標記物，僅使存活的細胞染色，而死細胞則不染色。本實驗結(jié)果顯示建立的純化培養(yǎng)RGCs體系是研究RGCs凋亡機制及神經(jīng)保護有效手段。

經(jīng)典的理論認為DR主要是微血管病變，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病早期視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能及穩(wěn)定性發(fā)生變化并參與視網(wǎng)膜病變的病理發(fā)展過程，且神經(jīng)病變的發(fā)生早于器質(zhì)性血管病變〔1〕。研究顯示，在未出現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管病理改變之前，就可見視網(wǎng)膜神經(jīng)的損傷，繼而出現(xiàn)視網(wǎng)膜功能改變，相干光斷層掃描檢查發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層明顯變薄〔2，5，6〕。動物實驗證實早期糖尿病時，RGCs發(fā)生凋亡〔7〕。糖尿病時，慢性高血糖引起體內(nèi)糖基化蛋白過量沉積形成AGEs。研究表明，AGEs的形成和沉積是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要發(fā)病機制。AGEs通過兩種方式發(fā)揮作用：非受體途徑即直接損傷和受體途徑，目前認為受體途徑是主要的。AGEs在局部沉積，通過與其受體結(jié)合激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致多種細胞因子與生長因子的合成與釋放，使視網(wǎng)膜中氧自由基生成增加，促使DR的發(fā)生〔3〕。本研究結(jié)果證實 AGEs能體外誘導(dǎo) RGCs發(fā)生凋亡。

caspase-3在凋亡所需的蛋白水解中起著直接作用，其水解底物多為細胞中的功能蛋白質(zhì)。研究表明，AGEs誘生劑glyoxal作用于具有視網(wǎng)膜神經(jīng)元表型的視網(wǎng)膜細胞系E1A-NR3，使細胞線粒體膜電位降低，caspase-3表達增加。AGEs誘生劑glyoxal作用于大鼠的視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)物，組織塊中bax及活化的 caspase-3 表達增加，視網(wǎng)膜各層凋亡細胞增加〔8，9〕，表明caspase-3參與了AGEs誘生劑glyoxal誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的凋亡。本研究顯示，在AGEs作用下，體外純化培養(yǎng)的RGCs發(fā)生凋亡，細胞caspase-3活性增加，提示AGEs可能通過增強細胞caspase-3活性誘導(dǎo)RGCs發(fā)生凋亡，造成RGCs損傷。在本研究基礎(chǔ)上，進一步觀察 caspase抑制劑對AGEs誘導(dǎo)的RGCs凋亡的影響，旨在抑制凋亡過程，為糖尿病時RGCs損傷提供神經(jīng)保護。

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