周曉慧 任立群 劉維朝 陳亞娟 董世超 張 楠 王 乾

(承德醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，河北 承德 067000)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺乏TLR4受體的小鼠心肌在缺血1 h后復(fù)灌24 h較保留TLR4受體的小鼠心肌有較小的心梗面積和較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)〔1〕。研究表明，丹皮酚具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗AS、抗腫瘤等廣泛的藥理作用〔2〕。丹皮酚是否能通過影響心肌梗死(MI)的心肌組織中TLR4及其下游炎癥因子腫瘤壞死因了(TNF)-α等的表達(dá)而發(fā)揮改善心室重構(gòu)的作用尚不明確，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究丹皮酚對(duì)MI兔心肌TLR4及其下游炎癥因子TNF-α表達(dá)的影響及其與心室重構(gòu)的關(guān)系，為丹皮酚抗MI后心室重構(gòu)的研究提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康家兔40只(體質(zhì)量1.5～2.0 kg，購(gòu)自承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 藥品與試劑 丹皮酚購(gòu)自安徽宣城百草植物工貿(mào)有限公司，純度99%，Trizol，美國(guó)Invitrogen公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒，大連寶生物工程有限公司;TLR4、TNF-α、β-actin引物，上海生物工程有限公司。

1.3 儀器 DB-3型心電圖機(jī)，上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司，BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

1.4 方法

1.4.1 兔MI模型建立與分組 將健康家兔用30 g/L戊巴比妥鈉 (30～50 mg/kg)，耳緣靜脈麻醉，胸骨正中切開，剪開心包，仔細(xì)辨認(rèn)冠狀動(dòng)脈左室支并結(jié)扎其中段，(假手術(shù)組只開胸，剪破心包，在相應(yīng)部位掛線不結(jié)扎)。以心電圖ST段抬高，局部心肌顏色變蒼白、節(jié)段性運(yùn)動(dòng)不良為判斷冠狀結(jié)扎成功(即模型成功)的標(biāo)志。術(shù)后24 h將存活兔分為4組：MI組(n=8)、假手術(shù)組(n=8)、MI+丹皮酚低劑量組(75 mg·kg－1·d－1，n=9)、MI+ 丹皮酚高劑量組(150 mg·kg－1·d－1，n=8)灌胃，連續(xù)4 w，MI組、假手術(shù)組每日以等量生理鹽水灌胃。

1.4.2 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定及標(biāo)本采集 4 w后稱取家兔體重(BW)，麻醉同前。右頸總動(dòng)脈插入直徑1 mm聚乙烯塑料管逆行進(jìn)入左心室，利用BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。分別記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室壓力最大上升和下降速率(±LV dp/dtmax)，記錄完畢后，導(dǎo)管內(nèi)注入10%氯化鉀3～5 ml處死兔，迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水中洗盡血液，剪除左、右心耳及殘余大血管后，以濾紙拭干，然后分別稱取右室重量(RVW)及左室重量(LVW)，分別計(jì)算與體重比值(即相對(duì)重量)。隨后將左心室自結(jié)扎線垂直于心臟長(zhǎng)軸分為心尖部(梗死區(qū)為主)與心底部(非梗死區(qū))切成100 mg左右小塊，無菌錫紙包裹液氮速凍24 h，－80℃冰箱凍存。

1.4.3 RT-PCR法檢測(cè)TLR4和TNF-α mRNA的表達(dá) 分別取各組心肌組織100 mg剪碎，用Trizol抽提組織總RNA，紫外檢測(cè)樣品吸光度值A(chǔ)，A260/A280為1.8～2.0。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)TLR4、TNF-α mRNA的表達(dá)。PCR中 TLR4的引物序列：上游引物：5 TGGGCTTAGAACAACTGGAAC 3下游引物：5 CAGAACCTGGAGGGAGTAGAG 3，擴(kuò)增片段：392 bp;TNF-α 的引物序列：上游引物：5 GTAGTAGCAAACCCGCAAGTG 3，下游引物：5 TGGGAGTAGATGAGGTACAGCC 3，擴(kuò)增片段：137 bp;β-actin：上游引物：5 CGTGCTGTCCCTGTACGCCTCT 3，下游引物：5 CGCTCGTTGCCGATGGTGAT 3，擴(kuò)增片段：348 bp，反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃，2 min，變性：94℃，30 s，退火：.TLR4 52℃，TNF-α 58℃，β-actin 62℃，延伸：72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物5 μl于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，160 V電壓，電泳2 h，紫外透射儀觀察并攝取圖像。應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析，以目的基因條帶的光密度與β-actin基因條帶光密度的比值，作為各目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)變化 術(shù)后4 w后，與假手術(shù)組比較MI組LVEDP顯著增加(P＜0.01);±LV dp/dtmax顯著降低(P＜0.01)，與MI組比較，丹皮酚低、高劑量組LVEDP顯著降低(P＜0.01)，±LV dp/dtmax明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化(s)

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化(s)

與假手術(shù)組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與 MI組比較：3)P ＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/ms)－dp/dtmax(mmHg/ms)138±15 2.10±0.95 5.55±0.45 4.10±0.55 MI組 8 117±111) 14.80±3.302) 3.56±0.382) 2.39±0.362)MI+丹皮酚低劑量組 9 128±133) 10.00±1.804) 4.88±0.563) 3.58±0.343)MI+丹皮酚高劑量組 8 132±164) 9.10±2.104) 4.96±0.353) 3.94±0.563)假手術(shù)組8

2.2 左、右心室相對(duì)質(zhì)量 術(shù)后4 w后，與假手術(shù)組比較，MI組左、右心室相對(duì)質(zhì)量顯著增加(P＜0.01)，與MI組比較，丹皮酚低、高劑量組左、右心室相對(duì)質(zhì)量顯著降低(P＜0.05)。見表2。

圖1 各組兔心肌組織TLR4、TNF-α mRNA的表達(dá)

2.3 TLR4、TNF-α mRNA表達(dá)的變化 術(shù)后4 w，與假手術(shù)組比較，MI組 TLR4、TNF-α mRNA 表達(dá)明顯提高(P ＜0.01)，與MI組比較，丹皮酚低TLR4、高劑量組TNF-α mRNA表達(dá)明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。見表3、圖1。

表2 各組心室重量/體質(zhì)量變化(s)

表2 各組心室重量/體質(zhì)量變化(s)

組別 n LVW/BW(g/kg)RVW/BW(g/kg)8 1.51±0.09 0.59±0.03 MI組 8 1.75±0.252) 0.80±0.071)MI+丹皮酚低劑量組 9 1.66±0.163) 0.70±0.123)MI+丹皮酚高劑量組 8 1.65±0.133) 0.68±0.113)假手術(shù)組

表3 各組心肌組織TLR4、TNF-α mRNA表達(dá)變化( s，n=4)

表3 各組心肌組織TLR4、TNF-α mRNA表達(dá)變化( s，n=4)

0.904 2±0.013 0.017 2±0.000 62 MI組 1.206 7±0.0251) 0.0271±0.000 161)MI+丹皮酚低劑量組 1.096 7±0.0232) 0.023 0±0.000 132)MI+丹皮酚高劑量組 0.990 0±0.0203) 0.019 4±0.000 202)-actin假手術(shù)組組別 TLR4/β-actin TNF-α/β

3 討論

自身免疫炎癥反應(yīng)在MI后心室重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用，TLR4是天然免疫系統(tǒng)的一種模式識(shí)別受體，是哺乳動(dòng)物將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白，為機(jī)體炎性反應(yīng)鏈的啟動(dòng)蛋白，其外源配體與內(nèi)源性配體等均可激活TLR4，通過信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終引起NF-κB的激活，上調(diào)TNF-α、IL-6等眾多的炎性因子表達(dá)〔3〕。另有研究表明高血壓大鼠心肌組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)水平升高，兩者高度正相關(guān);TLR4的表達(dá)水平與左室心肌纖維化呈正相關(guān)〔4〕，與左室心肌肥厚程度收縮功能指數(shù)顯著相關(guān)〔5〕。因此TLR4信號(hào)通路的活化介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，可能參與心室肥厚的發(fā)生發(fā)展。TLR4基因缺陷的大鼠，實(shí)驗(yàn)性心梗模型較野生性大鼠存活率明顯升高，心室重構(gòu)明顯減輕〔6〕。本研究結(jié)果表明TLR4信號(hào)通路在MI心室重構(gòu)中的作用，丹皮酚改善MI兔心室重構(gòu)作用可能與其抑制MI心肌TLR4及下游炎癥因子TNF-α的表達(dá)有關(guān)，但有關(guān)丹皮酚抑制MI心肌TLR4表達(dá)的分子機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步深入研究。

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