徐紅艷，包怡紅，劉富國，于陽陽

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉133000）

東北山核桃仁油增強小鼠學習記憶能力的研究

徐紅艷1，2，包怡紅1，*，劉富國1，于陽陽1

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉133000）

研究東北山核桃仁油（Juglans mandshurica oil，JMO）促進小鼠學習和記憶能力的影響。將雄性健康昆明種小鼠40只，隨機分為4組，即對照組（Control）、山核桃仁油低、中、高劑量組（Low、Middle、High）。Low、Middle、High劑量組分別灌胃山核桃仁油5、10、20mL/kg bw·d；對照組灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃30d。第31d開始，進行跳臺實驗和水迷宮實驗。結(jié)果山核桃仁油組小鼠跳臺被動回避的潛伏期明顯延長，記憶鞏固成績中中劑量組與對照組比較差異顯著（P＜0.05）；小鼠到達水迷宮終點的時間和錯誤次數(shù)明顯減少，中劑量組與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。研究表明，東北山核桃仁油能明顯提高小鼠跳臺被動回避反應能力和水迷宮空間辨別的學習記憶能力，具有明顯促進小鼠學習和記憶能力的作用。

東北山核桃仁油，小鼠，學習記憶

山核桃（Juglans mandshurica）又名胡桃楸、核桃楸、小核桃，為胡桃科胡桃屬落葉喬木。東北山核桃主要分布于東北的小興安嶺、完達山脈、長白山區(qū)及遼寧東部，在大興安嶺林區(qū)東南部也有少量分布。東北山核桃仁即為東北核桃楸種子的果仁部分，其營養(yǎng)價值很高，被譽為“世界四大干果之一”，含有較高的蛋白質(zhì)和油脂，以及多種維生素、氨基酸和鈣、鐵、磷等多種微量元素，其油脂中的脂肪酸組成，以不飽和脂肪酸為主?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，核桃久服可輕身益氣，是延年益壽的上品。長期以來，中醫(yī)早已肯定核桃仁的食療價值，認為它有多種療效，而核桃形似人腦，“以形補形”，加上豐富的蛋白質(zhì)和磷，被稱為“補腦”食物。但目前對山核桃仁多集中于營養(yǎng)成分的研究[1-2]，而對其功能作用尤其是對東北山核桃仁生物學功能特性的研究少有報道。本實驗以東北山核桃仁為原料，經(jīng)超臨界CO2萃取技術(shù)制備山核桃仁油，并對其改善小鼠學習和記憶能力方面進行了研究，旨在為東北山核桃的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北山核桃 由黑龍江省牡丹江地區(qū)林業(yè)局提供，當年采摘的山核桃進行挑選，剔除霉爛、蟲蛀等劣質(zhì)果品，烘干、去殼得山核桃仁，再粉碎、過篩、低溫烘干，經(jīng)超臨界CO2萃取脫油2次，制得山核桃仁油，貯存于4℃冰箱待用。設定超臨界CO2萃取條件為：分離壓力30MPa，分離溫度40℃，萃取時間3.5h；實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體重（25±2）g，由黑龍江省哈爾濱市松北華宏養(yǎng)殖場提供。

LW-O型水迷宮儀，WX-Ⅱ型跳臺儀 中國醫(yī)學科學院藥物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 跳臺實驗 健康的昆明種小鼠40只，適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為4組，即：對照組（Control）、山核桃仁油低、中、高劑量組（Low、Middle、High）。低、中、高組分別灌胃山核桃仁油5、10、20mL/kg bw·d；Control組灌胃生理鹽水。連續(xù)灌胃30d，每7d稱體重，按體重調(diào)整灌胃量。第31d開始跳臺實驗，開始時先將小鼠放在反應箱中適應環(huán)境3min，然后立即通以36V的交流電，小鼠受到電擊后，為逃避其反應是迅速跳上平臺，而部分小鼠會再次或多次跳至銅柵上，當受到電擊后又迅速跳回平臺，如此訓練5min，儀器自動記錄每只鼠受電擊的次數(shù)（錯誤次數(shù)），同時記錄每只小鼠再次跳下銅柵的潛伏期，以此作為記憶獲得的成績。24h后在底部銅柵通電的情況下，先將小鼠放入反應箱中適應環(huán)境120s，然后記錄第一次跳下的潛伏期和5min內(nèi)的錯誤次數(shù)，以此作為記憶鞏固的成績。

1.2.2 水迷宮實驗 實驗分組及灌胃方法同跳臺實驗。連續(xù)灌胃30d，第31d開始水迷宮游泳訓練，訓練期間繼續(xù)每天灌胃給樣。水迷宮泳道水深15cm，水溫控制在（25±1）℃。實驗時，將小鼠放于泳道的起點處，同時開始計時，觀察每只小鼠到達終點所需的時間以及出現(xiàn)錯誤的次數(shù)。實驗分階段進行，第一次的游程為水迷宮全程的1/3，以后逐步加長游程至水迷宮全程。第一次訓練前將小鼠放在梯子附近，使其自動爬上，反復3次，以后每次訓練前將小鼠放在梯子附近，使其自動爬上1次。最后計算各組記憶獲得和記憶鞏固的成績。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS11.50軟件進行數(shù)據(jù)處理，各組之間的比較用單因素方差分析，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 跳臺實驗

跳臺實驗中，各組小鼠被動回避的潛伏期和錯誤次數(shù)結(jié)果見表1。

由表1可以看出，記憶獲得成績中，與對照組相比，JMO低、中、高三個劑量組小鼠的錯誤次數(shù)均低于對照組，中、高劑量組的潛伏期延長；記憶鞏固成績中，與對照組相比，JMO中劑量組的潛伏期具有顯著性差異（P＜0.05），JMO低、中、高三個劑量組小鼠的錯誤次數(shù)均低于對照組。記憶鞏固成績與記憶獲得成績相比，JMO低、中、高三個劑量組小鼠的錯誤次數(shù)都相應減少，說明JMO具有提高小鼠記憶能力的作用。隨著實驗的進行，發(fā)現(xiàn)高劑量組小鼠攝食量明顯低于其他劑量組，主要是由于攝入了過多的油脂所致，從而影響了小鼠攝入營養(yǎng)的平衡，導致機體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常和某些生理機能下降，這可能是高劑量組小鼠的跳臺被動回避反應能力不及中劑量組的主要原因。

表1 山核桃仁油對小鼠跳臺被動回避反應能力的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of JMO on the capability of passive avoidance response of mice in pumping platform experiment（±s，n=10）

表1 山核桃仁油對小鼠跳臺被動回避反應能力的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of JMO on the capability of passive avoidance response of mice in pumping platform experiment（±s，n=10）

注：*p＜0.05，與對照組相比差異顯著；表2同。

項目 組別 潛伏期（s） 錯誤次數(shù)（5min內(nèi)）記憶獲得對照組 141.20±30.99 1.40±0.40低劑量組 139.80±69.69 1.20±0.45中劑量組 160.40±58.46 0.60±0.24高劑量組 152.00±47.42 1.00±0.37記憶鞏固對照組 144.80±49.71 1.20±0.58低劑量組 185.80±58.18 1.00±0.35中劑量組 279.80±23.53* 0.50±0.22高劑量組 217.15±22.27 0.90±0.33

2.2 水迷宮實驗

水迷宮實驗中，各組小鼠的到達終點時間和錯誤次數(shù)結(jié)果見表2。

表2 山核桃仁油對小鼠水迷宮實驗學習和記憶成績的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of JMO on the capability of space identification of mice in water maze experiment（±s，n=10）

表2 山核桃仁油對小鼠水迷宮實驗學習和記憶成績的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of JMO on the capability of space identification of mice in water maze experiment（±s，n=10）

項目 組別 到達終點時間（s）錯誤次數(shù)（5min內(nèi)）記憶獲得對照組 56.00±11.60 3.00±0.55低劑量組 53.70±15.32 2.60±0.24中劑量組 39.70±7.17 1.60±0.24*高劑量組 43.45±6.00 2.40±0.51記憶鞏固對照組 66.92±2.25 2.00±0.32低劑量組 64.02±7.38 1.70±0.37中劑量組 43.30±3.36* 0.90±0.33*高劑量組 53.85±7.16 1.30±0.30

由表2可以看出，記憶獲得成績中，JMO中劑量組的錯誤次數(shù)與對照組相比，有顯著性差異（P＜0.05），JMO低、中、高三個劑量組小鼠到達終點時間均低于對照組；記憶鞏固成績中，與對照組相比，JMO中劑量組的到達終點時間和錯誤次數(shù)均具有顯著性差異（P＜0.05），JMO低、中、高三個劑量組小鼠到達終點時間和錯誤次數(shù)均低于對照組。同時記憶鞏固成績與記憶獲得成績相比，JMO劑量組小鼠的錯誤次數(shù)都相應減少，說明JMO具有提高小鼠學習和記憶能力的作用。實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著實驗的進行，高劑量組小鼠攝食量明顯低于其他劑量組，分析可能是由于高劑量組小鼠攝入了過多的油脂所致，從而影響了小鼠攝入營養(yǎng)的平衡，導致機體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常和某些生理機能下降。這可能是高劑量組小鼠的水迷宮空間辨別能力不及中劑量組的主要原因，從而影響了學習記憶效果。

3 討論與結(jié)論

跳臺實驗和水迷宮實驗具有設備簡單、容易操作的優(yōu)點，并且能夠較為客觀地反映動物的認知水平，其中錯誤次數(shù)和跳臺潛伏期、水迷宮到達終點時間等幾項指標能比較準確地反映動物的自動回避和空間學習記憶能力，也是目前在改善學習記憶作用中常用的方法[3-4]。

學習和記憶是大腦的重要功能之一，是認知活動的重要方面，其過程較為復雜，而蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素以及微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)與神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)具有緊密聯(lián)系。研究表明，亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸以及微量元素、維生素等多成分能夠穩(wěn)定細胞膜功能，改善腦功能，降低血液黏稠度，提高免疫，開發(fā)嬰兒智力，以及在健腦益智和維持腦的高級功能方面起著重要作用[5-7]。

山核桃仁的營養(yǎng)價值很高，果仁含有蛋白質(zhì)、多種維生素和鈣、鐵、磷等多種微量元素。其油脂含量高，并且對人體健康有益的不飽和脂肪酸占有很大的比例，其中油酸和亞油酸的含量可達80%以上[8]。張怡等[9]通過水迷宮實驗研究了清梅汁改善小鼠記憶障礙的作用，彭欣莉等[10]通過跳臺和避暗實驗研究了蠶蛹油對小鼠記憶作用的影響，結(jié)果表明，通過攝食營養(yǎng)物質(zhì)在一定程度上可以改善或增強學習記憶的效果。本研究中小鼠灌胃JMO后，跳臺被動回避反應的潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少，記憶鞏固階段中劑量組被動回避反應的潛伏期明顯延長，與對照組比較差異顯著；水迷宮空間辨別能力增強，記憶獲得階段中劑量組錯誤次數(shù)明顯少于其他組，記憶鞏固階段中劑量組到達終點所需時間明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯減少，與對照組比較差異顯著。本研究結(jié)果與上述適當增加健腦益智營養(yǎng)物質(zhì)的攝入可提高學習記憶效果的研究結(jié)果相一致。其中，中劑量組增強小鼠記憶的效果優(yōu)于高劑量組，分析可能是由于劑量高導致小鼠攝入了過多的油脂，使血液中低密度脂蛋白（LDL）的含量提高，研究表明LDL過高是導致心腦血管疾病的主要原因[11]，從而使機體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，某種程度上影響了增強記憶的效果。

本研究表明，JMO可顯著提高小鼠跳臺被動回避反應能力，并能顯著增強小鼠水迷宮空間辨別學習和記憶能力，具有促進小鼠學習和記憶能力的作用，效果明顯。但由于記憶過程較為復雜，因此JMO促進學習記憶的作用機制仍需進一步研究。

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Study on Juglans mandshurica oil to improve learning and memory ability of mice

XU Hong-yan1，2，BAO Yi-hong1，*，LIU Fu-guo1，YU Yang-yang1
（1.Forestry College of Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Agricultural College of Yanbian University，Yanji 133000，China）

To investigate the effect of Juglans mandshurica oil（JMO）from northeastern on improving learning and memory in mice.Forty male KM mice were randomly divided into four groups：control group，JMO low dose group，JMO middle dose group and JMO high dose group respectively.Mice in control group were given physiological saline，and mice were given 5mL/（kg bw·d）by gavage in JMO low dose group，mice were given 10mL/（kg bw·d）by gavage in JMO middle dose group，and mice were given 20mL/（kg bw·d）by gavage in JMO high dose group for 30 days.Jumping platform experiment and water maze experiment were started on the thirty-first day.Latent period of mice on passive avoidance response in JMO groups obviously extended，compared with control group，difference of middle dose group was significant（P＜0.05），and arrived time to the end and error numbers obviously decreased，compared with control group，difference of middle dose group was significant（P＜0.05）.Results showed that JMO could increase the capability of learning and memory on passive avoidance response in jumping platform experiment and space identification in water maze experiment，and significantly possess the effect of improving learning and memory in mice.

Juglans mandshurica oil；mice；learning and memory

TS201.4

A

1002-0306（2012）05-0360-03

2011－03－30 *通訊聯(lián)系人

徐紅艷（1975-），女，博士研究生，講師，主要從事天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與功能性食品研究。

中央高校專項基金（LD09C14）。