涂宗財，張 露，王 輝，葉云花，劉 瑋

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)，江西南昌330022）

超聲波輔助提取藜蒿多酚工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

涂宗財1，2，張 露1，王 輝1，葉云花2，劉 瑋1

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)，江西南昌330022）

以藜蒿為原料，采用超聲波輔助法提取藜蒿多酚，研究其最佳提取工藝及體外抗氧化活性。結(jié)果表明：超聲波輔助提取藜蒿多酚的最佳條件為：液固比20∶1（mL/g），提取次數(shù)2次，乙醇濃度30%（v/v），超聲功率200W，提取時間80min，提取溫度80℃，在此條件下，多酚得率為1.858%±0.023%。體外抗氧化實(shí)驗表明：藜蒿多酚粗提液（PAST）的抗氧化能力隨多酚濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)多酚濃度大于148.80μg/mL時，PAST對DPPH·的清除能力高于BHA而與沒食子酸相當(dāng)；還原能力順序為：沒食子酸＞PAST＞BHA，在實(shí)驗濃度范圍內(nèi)，PAST的還原能力相當(dāng)于BHA的1.24～1.33倍。

藜蒿，多酚，超聲波，提取，抗氧化活性

近年來，多酚類物質(zhì)的生物活性及其對人體的保健防病作用日益受到人們的關(guān)注。許多流行病和實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)具有抗癌、降血壓、清除自由基、延緩機(jī)體衰老、減緩或抑制脂質(zhì)氧化和阻礙有毒氧化產(chǎn)物的形成等作用[1－2]。由于高血壓、糖尿病、心臟病等疾病在人群中發(fā)病率逐年增加，天然的無毒抗氧化資源的開發(fā)成為科學(xué)工作者急需解決的問題。藜蒿（Artemisia selengnesis Turcz）是菊科蒿屬植物，又名蔞蒿、狹葉艾，是以根莖和嫩莖供食的一種野生蔬菜，性涼、味甘、葉性平，具有清熱解毒、平抑肝火、祛風(fēng)濕、消炎和鎮(zhèn)咳等功效[3]。藥理研究證明，藜蒿具有保護(hù)肝臟[4]、抗真菌[5]、抗腫瘤和提高免疫[6]等功能。但從藜蒿中提取多酚類物質(zhì)以及酚類粗提液的抗氧化活性的相關(guān)研究很少，本實(shí)驗采用超聲波輔助醇提法，從藜蒿中提取多酚，研究料液比、提取次數(shù)、乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間和功率對多酚得率的影響，通過正交實(shí)驗得出最佳提取工藝，并測定藜蒿多酚粗提液的DPPH·清除能力和還原能力，為進(jìn)一步研究藜蒿的藥理和保健作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜蒿 于2011年4月采集于鄱陽湖，經(jīng)江西省農(nóng)科院鑒定；無水乙醇、Folin－Ciocalteu試劑、BHA、無水Na2CO3、FeCl3、K3[Fe（CN）6]等 均為分析純，購于天津永大化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸（分析標(biāo)準(zhǔn)品，＞99%） 購于阿拉??；DPPH 購于sigma公司。

KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外－可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；JD200－3B電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；V－1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；HH－4數(shù)顯水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 粗提液中總酚含量測定 采用Folin－Ciocalteau法，參照M Madhava Naidu[7]的實(shí)驗方法略加修改，于760nm處測定吸光值，以沒食子酸的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線回歸方程：Y=0.0112X+0.0068，R2=0.9994。

1.2.2 工藝流程[8－9]準(zhǔn)確稱取2.0g藜蒿粉末，加乙醇超聲提取，離心，收集上清液，沉淀中再加入等濃度等體積的乙醇浸提，離心，合并上清液（浸提次數(shù)=提取次數(shù)－1），濃縮，定容至100mL，取適量樣品溶液，按1.2.1測提取液中總多酚含量并計算得率。

1.2.3 單因素實(shí)驗 以藜蒿多酚得率為指標(biāo)，研究液固比（15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）、提取次數(shù)（1、2、3、4）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、超聲功率（80、120、160、180、200W）、超聲溫度（40、50、60、70、80℃）、超聲時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h）對藜蒿多酚得率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗 分析單因素實(shí)驗結(jié)果，確定對藜蒿多酚得率影響較大的4個因素，用L9（34）因素水平表進(jìn)行正交實(shí)驗（表1）重復(fù)三次。以藜蒿多酚得率為指標(biāo)，得出超聲波輔助提取藜蒿多酚的最佳工藝并對最佳工藝進(jìn)行驗證。

表1 L9（34）正交實(shí)驗因素水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal design

1.2.5 抗氧化性實(shí)驗

1.2.5.1 藜蒿多酚樣品的制備 在最佳工藝條件下提取藜蒿多酚，定容至100mL后測總酚濃度，得藜蒿多酚粗提液（PAST），備用。

1.2.5.2 DPPH·清除能力實(shí)驗[10]以0.372mg/mL的沒食子酸和BHA為標(biāo)準(zhǔn)對照，取2.0mL不同濃度（11.16～186.00μg/mL）的樣品溶液于比色管中，加入2.0mL 2×10－4mol/L DPPH溶液，充分混合后避光反應(yīng)30min，最后于510nm處測吸光值A(chǔ)i。用無水乙醇調(diào)零，重復(fù)三次，每次平行測兩次，計算清除率（IDPPH）。

式中：Acontrol：2.0mL無水乙醇和2.0mL DPPH的吸光值；Aj：2.0mL樣品溶液和2.0mL無水乙醇的吸光值。

1.2.5.3 還原能力實(shí)驗[11－12]向含有不同濃度（7.74～ 29.76μg/mL）樣品的1.5mL 0.2mol/L、pH6.6的磷酸鹽緩沖溶中加入1.5mL鐵氰化鉀溶液，搖勻，50℃反應(yīng)20min后加入1.5mL三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，再加入3.0mL去離子水和0.6mL FeCl3溶液，搖勻后于700nm處測吸光值。重復(fù)三次，每次平行測兩次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗結(jié)果分析

2.1.1 料液比對藜蒿多酚得率的影響 液固比對藜蒿多酚得率的影響如圖1所示，由圖可知，液固比為30∶1時多酚得率最高（1.19%±0.03%），其次為20∶1，由于溶劑提高10倍，多酚得率僅增加0.85%，考慮到乙醇的用量和后續(xù)加工工序，最佳液固比確定為20∶1。

圖1 液固比對多酚得率的影響（平均值±SD，n=6）Fig.1 Effect of liquid/solid ratio on polyphenol yield（mean±SD，n=6）

2.1.2 提取次數(shù)對藜蒿多酚得率的影響 提取次數(shù)對藜蒿多酚得率的影響如圖2所示，隨著提取次數(shù)的增加，多酚得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，提取3次時得率達(dá)最大，為1.13%±0.07%。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)越多，上清液顏色越深，靜置后生成的沉淀越多，這可能會使部分多酚被沉淀吸附導(dǎo)致多酚損失。由于提取2次后提取次數(shù)增加對多酚得率影響不大甚至出現(xiàn)下降，考慮到成本、耗時和樣品純度的綜合因素，提取次數(shù)確定為2次。

圖2 提取次數(shù)對多酚得率的影響（平均值±SD，n=6）Fig.2 Effect of extraction time on polyphenol yield（mean±SD，n=6）

2.1.3 乙醇濃度對藜蒿多酚得率的影響 乙醇濃度對藜蒿多酚得率的影響如圖3所示，隨乙醇濃度上升，多酚得率先上升后下降，在40%時有最高得率1.30%± 0.03%；當(dāng)濃度大于40%時，得率隨乙醇濃度的增加而降低。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，上清液低溫保藏過夜后均有深綠色沉淀生成，且乙醇濃度越高，沉淀物越多，這可能與溶劑的極性和提取物的溶解性有關(guān)，初步確定乙醇濃度為40%。

圖3 乙醇濃度對多酚得率的影響（平均值±SD，n=6）Fig.3 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield（mean±SD，n=6）

2.1.4 超聲功率對藜蒿多酚得率的影響 超聲功率對藜蒿多酚得率的影響如圖4所示，超聲功率為180W時，多酚得率最大，為1.40%±0.01%；當(dāng)超聲功率大于180W時，得率有微弱的下降。這可能是因為多酚具有熱不穩(wěn)定性，易氧化分解[13]，超聲波產(chǎn)生的瞬時高溫使部分熱不穩(wěn)定的目標(biāo)提取物分解而使多酚得率下降，因此，超聲功率初步確定為180W。

圖4 超聲功率對多酚得率的影響（平均值±SD，n=6）Fig.4 Effect of ultrasonic power on polyphenol yield（mean±SD，n=6）

2.1.5 超聲溫度對藜蒿多酚得率的影響 超聲溫度對多酚得率的影響如圖5所示，溫度對多酚得率的影響很大，多酚得率隨提取溫度的增加而增加，但溫度升高使能量消耗增大、成本增加，且在70℃之后，溫度增加10℃得率僅提高2.3%。綜合考慮儀器操作條件及能耗，提取溫度定為70℃。

圖5 超聲溫度對多酚得率的影響（平均值±SD，n=6）Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield（mean±SD，n=6）

2.1.6 超聲時間對藜蒿多酚得率的影響 超聲時間對多酚得率的影響如圖6所示，隨超聲時間的增加多酚得率先提高后下降。一般來說，提取時間越長，溶解出的胞內(nèi)物越多，但多酚不穩(wěn)定，熱處理時間越長越易氧化分解，使總酚含量下降[14]，且使提取液中雜質(zhì)含量升高，所以超聲時間定為1.0h。

圖6 超聲時間對多酚得率的影響（平均值±SD，n=6）Fig.6 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield（mean±SD，n=6）

2.2 正交實(shí)驗

表2 L9（34）正交實(shí)驗及極差分析結(jié)果Table 2 L9（34）trial schemes and range analysis results

正交實(shí)驗結(jié)果如表2所示，各因素的極差順序為：RC＞RD＞RA＞RB，即實(shí)驗因素對多酚得率影響的主次順序為：超聲時間＞超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲功率，由直觀分析可知，最佳因子組合為：A1B3C3D3，所以超聲波輔助提取藜蒿多酚的最佳工藝為：液固比20∶1（mL/g），提取次數(shù)2次，乙醇濃度30%（v/v），超聲功率200W，提取時間80min，提取溫度80℃，在此條件下藜蒿多酚的得率為1.863%。驗證性實(shí)驗多酚得率為1.858%±0.023%。

2.3 DPPH·清除能力實(shí)驗

圖7 PAST、沒食子酸和BHA對DPPH·的清除能力（平均值±SD，n=6）Fig.7 DPPH·scavening ability of ASTP，gallic acid and BHA（mean±SD，n=6）

PAST、沒食子酸、BHA對DPPH·的清除能力如圖7所示，由圖可知，隨三種物質(zhì)在反應(yīng)液中濃度的增加，其對DPPH·的清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度大于111.6μg/mL時，PAST對DPPH·的清除能力高于BHA；濃度高于148.80μg/mL時，PAST對DPPH·的清除能力與沒食子酸相當(dāng)（P＜0.05）；多酚濃度為186.00μg/mL時，DPPH·的清除率達(dá)97.00%±0.23%，因此藜蒿多酚具有很強(qiáng)的自由基清除能力，可成為開發(fā)抗氧化藥物的一種潛在資源。

2.4 還原能力實(shí)驗

在反應(yīng)體系中混合物吸光值的變化能指示出樣品的還原能力高低，吸光值越大樣品的還原能力越強(qiáng)，表明樣品的抗氧化活性越好[12]。由圖8可知，實(shí)驗樣品的還原能力與樣品濃度之間存在明顯的正向線性關(guān)系，多酚濃度越高，樣品的還原能力越強(qiáng)，三種樣品的還原能力為：沒食子酸＞PAST＞BHA（P＜0.01），在實(shí)驗濃度范圍內(nèi)（7.74～29.76μg/mL），PAST的還原能力為BHA的1.24～1.33倍。因此藜蒿多酚是一種良好的抗氧化劑。

圖8 PAST、沒食子酸和BHA的還原能力（n=6）Fig.8 Reducing power of PAST，gallic acid and BHA（mean±SD，n=6）

3 結(jié)論

3.1 超聲波輔助提取藜蒿多酚的最佳提取條件為：液固比20∶1（mL/g），提取次數(shù)2次，乙醇濃度30%（v/v），超聲功率200W，提取時間80min，提取溫度80℃。此時，藜蒿多酚的得率為1.863%，驗證實(shí)驗多酚得率為1.858%±0.023%。

3.2 體外抗氧化性研究表明，藜蒿多酚粗提液對DPPH·的清除能力和還原能力均隨多酚濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)多酚濃度大于111.6μg/mL時，粗提液對DPPH·的清除能力高于BHA；濃度高于148.80μg/mL時，粗提液對DPPH·的清除能力與沒食子酸相當(dāng)；相同濃度下，藜蒿多酚粗提液的還原能力比沒食子酸弱但高于BHA，在實(shí)驗濃度范圍內(nèi)，藜蒿多酚的還原能力相當(dāng)于BHA的1.24～1.33倍。因此，藜蒿多酚具有很好的抗氧化能力，藜蒿可成為開發(fā)抗氧化藥物的一種潛在資源。

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Study on optimization of ultrasound-assisted extraction of polyphenol from Artemisia selengnesis Turcz and its antioxidant activities

TU Zong-cai1，2，ZHANG Lu1，WANG Hui1，YE Yun-hua2，LIU Wei1
（1.State Key Lab of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China）

Taking Artemisia selengnesis Turcz as material，the optimum extracting conditions and antioxidant activity of polyphenol from Artemisia selengnesis Turcz（PAST）by ultrasound-assisted extraction was carried out.The optimal parameters were as follows：liquid/solid ratio 20∶1（mL/g），extraction times 2，ethanol concentration 30%（v/v），ultrasonic power 200W，ultrasonic time 80min and ultrasonic temperature 80℃，the highest yield（1.858%±0.023%）was obtained under this conditions.Antioxidant assays showed that the antioxidant activity of PAST increased with the increasing concentration of polyphenol.The scavenging ability on DPPH·of PAST was higher than that of BHA and corresponded to gallic acid when its concentration was above 148.80μg/mL. The reducing power of samples was：gallic acid＞PAST＞BHA.The reducing power of PAST，under tested concentration，was 1.24 to 1.33 fold of BHA.

Artemisia selengnesis Turcz；polyphenol；ultrasonic；extraction；antioxidant activity

TS201.1

B

1002－0306（2012）05－0239－04

2011－10－21

涂宗財（1965－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)與利用研究。

國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目（09C26213604437）；贛鄱英才555工程。