曹 慧，徐 斐

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093）

豆?jié){中脲酶活性測(cè)定方法的建立及酶學(xué)性質(zhì)的研究

曹 慧，徐 斐

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093）

生豆?jié){中的胰蛋白酶抑制因子在實(shí)驗(yàn)室中較難檢測(cè)，但其活性與脲酶活性呈正相關(guān)。對(duì)此建立了豆?jié){中脲酶的定量檢測(cè)方法，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，采用納氏試劑測(cè)定豆?jié){脲酶活性的最適條件為：波長(zhǎng)415nm，顯色劑用量1mL，尿素濃度3%，反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間7min。豆?jié){中脲酶的最佳作用pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為35℃，脲酶在25～40℃之間貯存3h有較好的熱穩(wěn)定性，酶活保留率在80%以上。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求得脲酶的Vmax為0.173mmol/min，Km為0.0172mol/L。

豆?jié){，脲酶活性，納氏試劑法，酶學(xué)性質(zhì)

豆?jié){因其富含植物性蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)元素，素有“植物肉”、“綠色牛乳”之美譽(yù)。但生豆?jié){中含有多種阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃腸脹氣因子等[1]。尤其是胰蛋白酶抑制因子能抑制胃蛋白酶、胰蛋白酶等幾十種蛋白酶的活性，導(dǎo)致蛋白消化和利用率降低，引起胰腺增生、腫大。胰蛋白酶抑制因子在實(shí)驗(yàn)室中較難檢測(cè)，但其變性失活程度與脲酶相似，因此我們常以脲酶活性作為判斷豆?jié){生熟度的標(biāo)準(zhǔn)[2]。脲酶（urease），又稱尿素酶或酰胺水解酶，能特異性地催化尿素水解，產(chǎn)生二氧化碳和氨，其催化反應(yīng)速度是常規(guī)化學(xué)催化的104倍，常被用于尿素或重金屬的快速檢測(cè)[3-4]。目前脲酶的測(cè)定方法主要有氨氣敏電極法定量法、pH增值法、國(guó)標(biāo)納氏試劑法等。利用氨氣敏電極測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)由脲酶作用所產(chǎn)生的氨數(shù)量可定量表示大豆脲酶活性的高低，此法操作較簡(jiǎn)單，但測(cè)定過(guò)程中氨容易逃逸，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大誤差[5]。尿素被樣品中的脲酶催化分解產(chǎn)生氨，導(dǎo)致溶液pH增加，增加的程度與脲酶活性大小呈正相關(guān)，因此可以用其與空白溶液的差值表示脲酶活性高低。pH增值法操作簡(jiǎn)單、試劑少，但是計(jì)算結(jié)果不易比較，不夠直觀[6]。國(guó)標(biāo)法是利用脲酶水解產(chǎn)生的氨，在適當(dāng)條件下能與納氏試劑中的碘化鉀汞復(fù)鹽作用生成棕色的碘化雙汞銨。國(guó)標(biāo)法靈敏度較高，但只能定性檢測(cè)，且過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)也較長(zhǎng)[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立一種脲酶的定量檢測(cè)方法，并對(duì)大豆脲酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碘化汞、碘化鉀、（NH4）2SO4、尿素、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、三氯乙酸等試劑 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純。

722S型分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；SZ－93自動(dòng)雙重純水蒸餾器 北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；HY－6多用振蕩器 金壇市醫(yī)療器械廠；J2－HS型臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；SHZ－88臺(tái)式水浴恒溫振蕩器 上海醫(yī)療器械七廠；九陽(yáng)料理機(jī) 杭州九陽(yáng)小家電有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 納氏試劑的配制 稱取5.5g碘化汞、4.125g碘化鉀溶于25mL水中，溶解后轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中。再稱取14.4g氫氧化鈉溶于50mL水中，待溶解冷卻后，慢慢轉(zhuǎn)移到上述100mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后倒入試劑瓶中，靜止后取上層清液。

1.2.1.2 硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制 精確稱取硫酸銨0.9910g（60℃干燥至恒重）加蒸餾水溶解后定容至1000mL容量瓶中，此溶液為1mL≈15μmol的NH4+的貯存液。精確吸取10mL貯存液，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此溶液為1mL≈1.5μmol的NH4+。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 準(zhǔn)確吸取硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（對(duì)應(yīng)NH4+濃度為0.0、0.75、1.5、2.25、3.0、3.75、4.5μmol）分別置于7支25mL具塞比色管中，加水至9mL，各加納氏試劑1mL。于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值。根據(jù)測(cè)得的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 豆?jié){脲酶活性檢測(cè)方法的確定 取30g大豆，置于250mL蒸餾水中浸泡4h，用料理機(jī)打碎，取1mL定容至50mL容量瓶中。取1mL豆?jié){稀釋液，加入1mL尿素溶液（濃度分別為0.5%、1%、3%、5%、7%），恒溫水浴反應(yīng)（反應(yīng)時(shí)間分別為3、5、7、9、11、13min；反應(yīng)溫度分別為25、30、35、40、45℃），反應(yīng)完畢后加入1mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩均勻。3000r/min離心5min，取上清液0.5mL置于納氏試管中，各加8.5mL蒸餾水及1mL納氏試劑，于415nm處測(cè)定吸光值。豆?jié){中脲酶酶活定義為：在35℃時(shí)，每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氨的酶量為1個(gè)酶活力單位，計(jì)算公式為：

式中：a：經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線所查得的樣品管中的NH4+的微摩爾數(shù)。

1.2.4 脲酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 將生大豆粉碎，經(jīng)過(guò)35%乙醇浸提、多步分離純化、最后利用真空冷凍干燥制得大豆脲酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。

1.2.4.1 溫度穩(wěn)定性 分別在25、30、35、40、45、50、55℃下將脲酶酶液保溫3h，檢測(cè)其在不同溫度下保溫后的酶的活力變化情況。

1.2.4.2 脲酶的最適反應(yīng)pH 分別在pH5、6、7、8和9下測(cè)定脲酶的活力。

1.2.4.3 米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax的測(cè)定 在不同濃度尿素下測(cè)定反應(yīng)的初速度，然后按Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖法求得酶反應(yīng)的米氏常數(shù)，再由縱軸截距求出酶反應(yīng)的最大反應(yīng)速度Vm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 吸取1mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法顯色，以空白為參比在400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，待測(cè)樣品反應(yīng)液在415nm有最大吸收峰，故選擇415nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 顯色劑用量的確定 脲酶水解尿素產(chǎn)生的氨，在適當(dāng)條件下能與納氏試劑中的碘化鉀汞復(fù)鹽作用生成棕色的碘化雙汞銨。因此，在415nm波長(zhǎng)下考察不同顯色劑用量對(duì)吸光值的影響。由圖1可見，隨著顯色劑用量的增加，吸光值呈直線上升趨勢(shì)，當(dāng)顯色劑用量增加到1mL時(shí)，吸光值呈微弱下降的趨勢(shì)。因此，選擇顯色劑1mL為最適用量。

圖1 納氏試劑用量對(duì)吸光值的影響Fig.1 Effect of nessler reagents amount on the color development

2.1.3 硫酸銨的標(biāo)準(zhǔn)曲線 在415nm波長(zhǎng)、1mL顯色劑用量下，以不同濃度的NH4+為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖2可見，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.2234x+ 0.0436，R2=0.9937，當(dāng)NH4+的微摩爾數(shù)在0.75～4.5時(shí)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of ammonium sulfate

2.2 豆?jié){脲酶活性檢測(cè)條件的確定

2.2.1 尿素濃度的確定 脲酶能專一性地分解尿素產(chǎn)生氨，因此以尿素為底物，考察不同尿素濃度對(duì)脲酶酶活的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，隨著尿素濃度的增加，酶活呈增加趨勢(shì)，當(dāng)尿素濃度增加到3%時(shí)，酶活呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，這可能是由于底物已達(dá)到飽和。因此，選擇3%的尿素作為最適底物濃度。2.2.2 反應(yīng)溫度的確定 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的測(cè)定有顯著影響，因此考察了不同反應(yīng)溫度對(duì)脲酶酶活的影響。由圖4可見，隨著反應(yīng)溫度的升高，脲酶酶活呈增加趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，酶活逐漸下降。因此，選擇35℃作為最適的反應(yīng)溫度。

圖3 尿素濃度對(duì)脲酶酶活的影響Fig.3 Effect of urea amount on urease activity

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)脲酶酶活的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on urease activity

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間的確定 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活的影響如圖5所示。由圖5可見，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脲酶酶活呈上升趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到9min時(shí)，酶活趨于平穩(wěn)。因此，根據(jù)酶初速度的定義，選擇7min作為最適的反應(yīng)時(shí)間。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脲酶酶活的影響Fig.5 Effect of reaction times on urease activity

2.3 脲酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

圖6 脲酶反應(yīng)的最適pHFig.6 Optimal pH of urease

2.3.1 酶反應(yīng)的最適pH 脲酶最適反應(yīng)pH如圖6所示。由圖6可見，隨著pH的上升，脲酶的活力逐漸增加，當(dāng)pH達(dá)到7.0時(shí)，酶活力最大，隨后又逐漸下降。因此，脲酶的最適pH在7.0左右。

2.3.2 酶反應(yīng)溫度穩(wěn)定性 脲酶最適反應(yīng)溫度如圖7所示。由圖7可見，脲酶在25～40℃之間有較好的熱穩(wěn)定性，保存3h酶活保留率都在80%以上。當(dāng)酶液在50℃時(shí)，酶活保留率仍在50%左右。

圖7 脲酶的溫度穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of urease

2.3.3 米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax的測(cè)定 在pH7.0，反應(yīng)溫度35℃的條件下，以尿素為底物，測(cè)定不同底物濃度下反應(yīng)的初速度，按Lineweaver－Burk作圖法取雙倒數(shù)作1/v－1/[s]曲線（見圖8），計(jì)算Vmax= 0.173mmol/min，米氏常數(shù)Km為0.0172mol/L。

圖8 1/v－1[s]曲線Fig.8 1/v－1/[s]curve

3 結(jié)論

本文建立了大豆脲酶的定量測(cè)定方法，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果表明，納氏試劑測(cè)定脲酶的最佳吸收波長(zhǎng)為415nm，顯色劑用量為1mL，當(dāng)NH4+的微摩爾數(shù)在0.75～4.5μmol時(shí)呈良好的線性關(guān)系。脲酶酶活測(cè)定最佳反應(yīng)條件為：尿素濃度3%，反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間7min。脲酶活力隨著pH的增加而增大，pH為7時(shí)，脲酶活力最高。脲酶反應(yīng)的最適溫度為35℃，脲酶在25～40℃之間有較好的熱穩(wěn)定性。利用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖法求得酶的Vmax=0.173mmol/min，Km為0.0172mol/L。通過(guò)對(duì)大豆脲酶活性的測(cè)定以及酶學(xué)性質(zhì)的研究，為采用此酶快速測(cè)定尿素及重金屬的殘留奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]吳非，霍貴成.酶法鈍化大豆胰蛋白酶抑制劑研究[J].糧食與油脂，2002（6）：9－10.

[2]Kunitz M.Cristallization of a trypsin inhibitor from soybean [J].Science，1985，101：668－691.

[3]Katsuro M， Motoo S.Purification characterization and application of an acid urease from Arthobacter mobilis[J].Journal of Biotechnology，1999，68：227-236.

[4]陳秀云，李湘鳴.豆?jié){中脲酶活性的測(cè)定[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2002（3）：63-64.

[5]徐茂軍，樂培恩，鄭凱.氨氣敏電極法定量測(cè)定大豆脲酶活性[J].食品科學(xué)，1993（9）：64-68.

[6]楊奇慧，舒璐，鐘劍鋒.不同方法測(cè)定大豆脲酶活性的比較研究[J].飼料廣角，2008，21：30-32.

[7]QB/T 2132-2008植物蛋白飲料豆奶（豆?jié){）和豆奶飲料[S].附錄A脲酶的定性測(cè)定.

Establishment of determination method of urease in soybean juice and the enzymology characteristics

CAO Hui，XU Fei
（Medical Equipment and Food Institute，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China）

The determination of trypsin inhibitor in the laboratory was very difficult，but the activity of urease was positively correlated with trypsin inhibitor concentration.Therefore，we established the measuring method for urease activity，and then the enzymology characteristics were studied.Results showed that the optimal values for urease activity as follows：detection wavelength 415nm，amount of nessler reagents 1mL，urea concentration 3%，reaction temperature 35℃，reaction time 7min.Meanwhile，the optimum reaction pH and temperature of soybean urease was 7.0 and 35℃，respectively.Incubation at 25～40℃for 3h，the retention rate of enzyme activity was above 80%.The Kmand Vmaxof urease were 0.173mmol/min and 0.0172mol/L，respectively.

soybean milk；urease；nessler’s method；enzymology characteristics

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）01-0106-04

2010－09－06

曹慧（1976-），女，講師，博士，研究方向：功能性配料及添加劑。

上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項(xiàng)基金（Slg08030）。