牛 鑫，汪 泱，殷俊輝，胡 斌，郭尚春，何海燕，鄧志鋒

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，1、四肢顯微外科研究所；2、神經(jīng)外科，上海 200233)

近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后在缺血損傷區(qū)有血管新生，一定程度上能促進缺血區(qū)神經(jīng)功能修復(fù)，但其相關(guān)調(diào)控機制仍需要進一步研究[1,2]。越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳學(xué)相關(guān)的信號通路在修復(fù)過程中可能起到重要作用。在表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要過程——組蛋白的修飾過程中，組蛋白乙酰化酶HDAC(histone deacetylase)家族是重要的參與者[3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)18個HDAC家族成員，通過過乙?；蛞种埔阴；瘉砩险{(diào)或者下調(diào)基因的表達，參與多種生命過程。其中HDAC1能夠促進血管生成[4,5]，HDAC4能夠抑制血管生成[6]。雖然HDAC1-11在大鼠腦中都有表達[7]，但是，它們是否在腦缺血的過程中也發(fā)揮調(diào)控作用，是否參與腦缺血后血管新生調(diào)節(jié)機制，目前還沒有報道。我們通過構(gòu)建大鼠急性腦缺血模型，檢測腦缺血后24h缺血皮質(zhì)區(qū)HDAC家族成員HDAC1、HDAC2、 HDAC3、 HDAC4、 HDAC6、 HDAC10、HDAC11的表達水平，以明確其在腦缺血后的變化，初步探討其在腦缺血后血管新生中的可能調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級成年 (7～9周)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，重量250～300g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。所有動物實驗都按照動物實驗倫理委員會的規(guī)定進行。

1.1.2 主要儀器 實時定量PCR儀7500(美國ABI)

1.3 主要試劑 QIAGEN Allprep RNA/DNA/Protein mini Kit試劑盒、Promega A3500 cDNA第一鏈合成試劑盒、TOYOBO Sybr Green 2×PCR Master熒光定量檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 參考改良的Longa法制作大腦中動脈阻塞缺血損傷模型：麻醉大鼠后，暴露右側(cè)頸總動脈，頸內(nèi)動脈和頸外動脈，于頸外動脈近心端管壁上做一“V”形切口，從切口插入一特制4.0線栓至頸內(nèi)動脈后，繼續(xù)緩慢滑入至大腦中動脈起始部，阻塞大腦中動脈，插入長度約距頸總動脈分叉處1.8cm；2h后取出線栓，縫合傷口放回籠內(nèi)。假手術(shù)組僅暴露動脈，不做線栓阻塞缺血處理。MCAO大鼠麻醉清醒后參照Zea Longa法行神經(jīng)功能評分，1～3分者納入實驗研究對象。將大鼠隨機分缺血后1d組與假手術(shù)組。缺血處理后24h，用500ml無菌生理鹽水心臟灌注后游離出完整腦組織，-20℃下放置30min后，用RNase free刀片切取缺血皮質(zhì)區(qū)約100mg，存于RNase free EP管中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時留取假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū)為實驗對照。

1.2.2 RNA的提取 按QIAGEN Allprep RNA/DNA/Protein mini Kit提取分離試劑盒說明書操作

1.2.3 總RNA純度和濃度的檢測 使用超微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，記錄OD260值。RNA純度檢測：RNA溶液的OD260/OD280的比值(比值范圍1.8～2.1為純度合格)。樣品RNA濃度計算公式為：OD260×40×稀釋倍數(shù)(ng/μl)。

1.2.4 cDNA的合成按Promega A3500 cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作。

1.2.5 實時定量PCR按TOYOBO Sybr Green 2×PCR Master熒光定量檢測試劑盒說明書操作。以GAPDH 為內(nèi)參。 反應(yīng)條件：95℃，1min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 40s。40個循環(huán)。引物序列及 PCR 產(chǎn)物片段大小見表1。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。t-檢驗P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 熒光定量PCR引物列表

圖1 腦缺血后缺血皮質(zhì)區(qū)HDAC的表達變化

HDAC家族各成員在腦缺血后表達水平均有所改變：如圖1所示，血皮質(zhì)區(qū)的HDAC1，HDAC10表達均高于假手術(shù)組。其中HDAC1的表達量顯著高于假手術(shù)組。實驗結(jié)果表明，腦缺血后體內(nèi)缺血缺氧環(huán)境可刺激HDAC1的表達。

3 討論

當(dāng)前，積極促進缺血區(qū)的血運重建已經(jīng)成為治療腦缺血性疾病的共識。然而腦缺血后血管新生機制十分復(fù)雜，積極深入探尋其新的調(diào)控途徑仍是眾多學(xué)者的研究重點。實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，腦缺血后1d即可檢測到HDAC家族成員表達開始改變；證實了腦缺血后，體內(nèi)缺血缺氧環(huán)境可迅速影響其的表達。根據(jù)Aurora等人的報道，HDAC1具有顯著的促進血管生成的功能。在我們的實驗結(jié)果中，缺血組大鼠大腦皮層的HDAC1表達水平顯著上調(diào)，提示缺血手術(shù)后皮層代償性增生血管生長促進因子，促進血管修復(fù)，從而修復(fù)缺血帶來的損傷。這同時表明，HDAC1對于缺血損傷的應(yīng)激非常迅速。HDAC是廣泛表達于多種組織的表達調(diào)控因子。其它已經(jīng)被證實的可以在發(fā)育過程中或者癌癥發(fā)生過程中抑制血管生成的HDAC家族成員，比如，HDAC4，HDAC5，HDAC6[6,8-10]，在本次實驗中未顯示出與對照組的顯著性差異，或者，沒有被檢測到。這提示HDAC家族成員在不同的組織、生命過程中功能不同?；蛘卟煌易宄蓡T的應(yīng)激速度不同。腦缺血后血管新生過程早期很可能只包含HDAC1家族成員參與發(fā)揮作用。本實驗初步明確了腦缺血后缺血皮質(zhì)區(qū)HDAC家族基因的表達變化，為今后深入探討HDAC家族基因?qū)δX缺血后血管新生的調(diào)控作用提供了實驗依據(jù)。

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