朱良全，李聰研，蔣玉文，田冬青，孫 曄

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.北京中海生物科技公司，北京 100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，又稱魏氏梭菌(Clostridium welchii)，依據(jù)其主要致死性毒素與其抗毒素中和試驗，可將此菌分為A、B、C、D和E 5個型。其中A型菌能導(dǎo)致人類氣性壞疽和食物中毒，也是多種動物疾病的病原菌，如兔、禽及仔豬的壞死性腸炎和腸毒血癥［1］。其致病因子主要是α毒素，免疫的關(guān)鍵在于抗毒素［2-4］。

目前，我國A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病滅活疫苗生產(chǎn)采用的是傳統(tǒng)培養(yǎng)基，如厭氣肉肝湯和肉肝胃酶(膜)消化湯［5］。該培養(yǎng)基培養(yǎng)厭氧菌效果好，毒力強(qiáng)，但在實際生產(chǎn)中存在以下問題:(1)成分復(fù)雜，難以標(biāo)準(zhǔn)化。其主要成分牛肉和肝等，受動物品種、年齡、新鮮程度影響大，造成培養(yǎng)基批次間質(zhì)量不穩(wěn)定。(2)廣譜性高，專一性弱。該培養(yǎng)基適用于多數(shù)厭氧菌的培養(yǎng)，有效產(chǎn)毒因子不足。(3)制作繁瑣，需經(jīng)驗因素。牛肉及肝處理、煮沸及濾過，胃酶(膜)的活力及消化程度判斷，需要較高的經(jīng)驗值。針對上述缺點，本課題組研制成功A型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基。為進(jìn)一步明確A型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基使用參數(shù)，對合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件、菌株的適用范圍及培養(yǎng)毒素的濃縮工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為我國A型產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗大規(guī)模生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株(原C57-1株)、CVCC52株、CVCC2027株、CVCC2030株、CVCC2014株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏室鑒定、保管和供應(yīng)。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液 厭氣肉肝湯，批號為20091223;肉肝胃酶(膜)消化湯，批號分別為20100105、20100112、20100119;明膠緩沖液(稀釋毒素用)，批號為20100201。由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障處提供。

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基:主要成分為蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、生長因子等。批號:201001，由北京中海生物科技有限公司提供。

1.1.3 實驗動物 小白鼠，CD-1品系，16～20 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。

1.1.4 濃縮設(shè)備 Easy-load蠕動泵，型號為NO.XX80EL230;PERMEATE儀，生產(chǎn)編號:X142POO.80;0.5m2的8 ku及10 ku截留分子量(MW)超濾膜購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株種子液的制備將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CVCC37)凍干菌種用1 mL肉肝胃酶消化湯稀釋后，吸取菌液0.1 mL接種于10 mL的肉肝胃酶消化湯中，置37℃靜置培養(yǎng)18～24 h，作為種子液。

1.2.2 菌液的培養(yǎng) 按說明書稱取A型合成培養(yǎng)基，用相應(yīng)體積的去離子水將各成分充分溶解，調(diào)pH值至8.3，116℃滅菌30 min，待溫度降至室溫，將種子液按培養(yǎng)基體積的1%接種，37℃靜置培養(yǎng)6 h。

1.2.3 毒素的制備 培養(yǎng)好的菌液以3000 r/min離心 30 min，吸取上清，0.22 μm 濾膜過濾除菌，即為毒素，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 菌液毒力(MLD)的測定 將毒素用明膠緩沖液作適當(dāng)稀釋，使0.2 mL稀釋液中分別含有0.01 mL(20 倍稀釋)、0.02 mL(10 倍稀釋)、0.03 mL(6.6倍稀釋)和0.04 mL(5倍稀釋)的毒素，各尾靜脈注射16～20 g的小白鼠2只，每只0.2 mL，在24 h內(nèi)全部死亡的最大稀釋度乘以5，即為每1 mL毒素所含的最小致死量(MLD)數(shù)。

1.2.5 pH值對合成培養(yǎng)基產(chǎn)毒的影響 配制A型培養(yǎng)基溶液各1000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)整 pH 值至 7.0、7.5、8.0、8.5 及9.0，116 ℃滅菌 30 min。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測定，各進(jìn)行3批，批號分別為A1001、A1002、A1003。

1.2.6 高壓滅菌對合成培養(yǎng)基產(chǎn)毒的影響 配制A型培養(yǎng)基溶液各1000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整 pH值至8.3。分別以116℃滅菌30 min、121℃滅菌 15 min、121℃ 滅菌30 min。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4 法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測定，共進(jìn)行3 批，批號分別為 A1011、A1012、A1013。

1.2.7 配制用水對合成培養(yǎng)基產(chǎn)毒的影響 對A型合成培養(yǎng)基分別用去離子水、反滲透純化水、蒸餾水配制成1000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液預(yù)先調(diào)整 pH8.3。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4 法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測定，共進(jìn)行 3批，批號分別為A1021、A1022、A1023。

1.2.8 合成培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的確定 按說明書配制A型培養(yǎng)基6甁，1000 mL/瓶，將種子液按培養(yǎng)基體積的1%接種，其中1甁置37℃培養(yǎng)20 h，期間分別于4、6、8、10、12、14、16、18 和20 h 先后取樣5 mL;另外5 甁，分別置35、36、37、38 和 39 ℃培養(yǎng)6 h 后取樣5 mL，然后按 1.2.3、1.2.4 法取其上清進(jìn)行毒力測定，確定最佳產(chǎn)毒的時間和培養(yǎng)溫度。

1.2.9 配制成的培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基對比試驗按上述篩選條件配制A型培養(yǎng)基3批，1000 mL/批，批號為 A201001、A201002、A201003，與 3 批肉肝胃膜消化湯進(jìn)行比較。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測定。

1.2.10 合成培養(yǎng)基對不同A型菌株的培養(yǎng)試驗為確定合成培養(yǎng)基對不同A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的培養(yǎng)情況，取5株A型產(chǎn)氣莢梭菌菌株，菌號分別為 CVCC37、CVCC52、CVCC2027、CVCC2030、CVCC2014，在35和37℃進(jìn)行培養(yǎng)，分別在5 h和7 h取樣，按1.2.3、1.2.4 法取其上清進(jìn)行毒力測定。

1.2.11 毒素濃縮工藝的優(yōu)化 配制A型培養(yǎng)基5000～6000 mL，并按上述優(yōu)化條件培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株，培養(yǎng)好菌液經(jīng)3000 r/min離心30 min，去除菌體，分別用不同截留分子量的millipore超濾濃縮系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行濃縮前、后體積定量，并取濃縮前、后及透出液樣品各10 mL按1.2.4法進(jìn)行毒力測定。

2 結(jié)果

2.1 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基pH值、高壓條件、培養(yǎng)用水優(yōu)化結(jié)果 從表1-表3看出，最適pH 值范圍為8.0～8.5，滅菌條件為116 ℃30 min，配制用水為去離子水。

2.2 不同培養(yǎng)時間及培養(yǎng)溫度產(chǎn)毒結(jié)果 從表4和表5看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)CVCC37株6小時后毒力達(dá)到50～100 MLD/mL，隨著時間的延長，毒力不再增強(qiáng);培養(yǎng)溫度為36℃或37℃，產(chǎn)毒效果最佳。

表1 不同pH值培養(yǎng)基的產(chǎn)毒結(jié)果(MLD/mL)

表2 不同高壓條件培養(yǎng)基的產(chǎn)毒結(jié)果(MLD/mL)

表3 不同配制用水培養(yǎng)基產(chǎn)毒結(jié)果(MLD/mL)

表4 不同培養(yǎng)時間產(chǎn)毒結(jié)果

表5 不同培養(yǎng)溫度產(chǎn)毒結(jié)果

2.3 合成培養(yǎng)基與肉肝胃膜消化湯對比結(jié)果 從表6看出，A型合成培養(yǎng)基可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)基。

2.4 合成培養(yǎng)基對不同A型菌株的培養(yǎng)試驗結(jié)果從表7看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株產(chǎn)氣量最大，毒力最強(qiáng)。

2.5 培養(yǎng)毒素濃縮條件優(yōu)化結(jié)果 從表8看出，10 ku截留分子量的收獲率為40%，其透出液靜脈接種 0.2 mL，小鼠2/2 死亡;而8 ku收獲率達(dá)75%，其透出液透出液靜脈接種0.2 mL，小鼠0/2死亡;因此8 ku截留分子量的膜包適宜對A型菌培養(yǎng)毒素的濃縮。

表6 合成培養(yǎng)基和肉肝胃酶消化湯毒力比較結(jié)果

表7 合成培養(yǎng)基培養(yǎng)不同A型菌株結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 α毒素是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要分泌毒素，也是主要免疫原，其分子量為42.5 ku。影響α毒素產(chǎn)量因素較多，如菌株類型、菌株毒力、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)過程中的溶解氧和培養(yǎng)基組成及各組分的比例等［6］。通過對A型合成培養(yǎng)基使用參數(shù)進(jìn)行試驗，確定最適滅菌方式為116 ℃、30 min;pH 值為8.0 ～8.5;配制用水為去離子水;合成培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株在6 h后毒力達(dá)到50～100 MLD/mL，隨著培養(yǎng)時間的延長，毒力不再增強(qiáng);當(dāng)培養(yǎng)溫度在36～37℃時，產(chǎn)毒效果最佳。

表8 不同截留分子量膜包的濃縮結(jié)果

3.2 該A型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基專一性強(qiáng)，僅對制苗用標(biāo)準(zhǔn)株產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株產(chǎn)生較強(qiáng)的毒力，對其余5種菌株產(chǎn)氣量小，產(chǎn)毒性能弱。這說明合成培養(yǎng)基的成分與菌株類型、代謝特點密切相關(guān)。另外培養(yǎng)基的起始pH值較高，可能是由于pH值降低會對α毒素蛋白酶產(chǎn)生破壞作用。

3.3 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)時間的報道也不盡相同，Gale和Van Heynlngen認(rèn)為培養(yǎng)4～5 h，α毒素產(chǎn)量最高［6］，也有人認(rèn)為 8 h 后產(chǎn)毒量最大［7］;郭明章［8］等研究產(chǎn)氣莢膜梭菌NJ-l株培養(yǎng)5～6 h的毒素產(chǎn)量最高和活性最強(qiáng)。我們研究結(jié)果顯示6 h可達(dá)最高。同時也證明與菌株活力、培養(yǎng)起始pH值、培養(yǎng)基成分、種子液濃度等有著密切的關(guān)系［7］。

3.4 超濾濃縮系統(tǒng)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于獸用生物制品疫苗的生產(chǎn)。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)毒素分別用不同截留量分子的millipore超濾濃縮系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，10 ku分子截留量的收獲率為40%，其透出液含毒，且能致死小鼠，8 ku收獲率達(dá)75%，其透出液中不含毒，因此用8 ku分子截留量的膜包適宜對A型菌培養(yǎng)毒素進(jìn)行濃縮。另外該試驗有效濃縮可達(dá)26.6倍，耗時40 min，濃縮倍數(shù)遠(yuǎn)高于報道中 7 倍［9］，適合接種劑量低的禽壞死性腸炎滅活疫苗和多價梭菌滅活苗的研制和生產(chǎn)。另外超濾濃縮，具有樣品量大、處理快速、重復(fù)利用率高等特點，適合大規(guī)模生產(chǎn)。并可克服傳統(tǒng)硫酸銨提取工藝中存在的難題:如滅活脫毒菌液經(jīng)硫酸銨沉淀后，有效成分懸浮于上清表面，粘度大，需用芍撈取或其它方法機(jī)械提取，在操作間需曝露并產(chǎn)生粒子、不適于GMP生產(chǎn)［10-11］。另外傳統(tǒng)的氫氧化鋁膠苗，其吸附效果差，存在有效抗原成分大量流失問題。因而采取濃縮凍干是厭氧菌滅活菌苗生產(chǎn)工藝變革的新趨勢。

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