趙召霞 梅志勤 戴二黑

阿德福韋酯是被批準(zhǔn)上市的第二大類核苷類似物藥物，因具有單磷酸腺苷的無環(huán)磷酸化核苷類似物，在細(xì)胞磷酸化為二磷酸鹽，發(fā)揮抑制乙肝病毒多聚酶的作用，因而用于乙型肝炎病毒野毒株和拉米夫定耐藥相關(guān)的YMDD變異株的慢性乙型肝炎患者的治療。目前文獻報道乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，rt)區(qū)N236T突變是阿德福韋酯的標(biāo)志性耐藥位點，而A181T突變也是阿德福韋酯的主要耐藥位點［1］，但各自的病毒學(xué)特征是否有差異，目前的報道甚少，因此本研究對阿德福韋酯治療過程中發(fā)生病毒學(xué)突破的慢性乙型肝炎患者進行rtN236位點、rtA181位點以及兩者聯(lián)合突變的分析，報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2009年8月至2010年12月在我住院或門診就診的慢性乙型肝炎患者42例，男31例，女11例;年齡19～65歲，平均年齡(44±12)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2000年全國病毒性肝炎與肝臟學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，均排除其他肝炎病毒感染、藥物或酒精性肝病。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)口服阿德福韋酯，10 mg/d，療程在6個月以上。(2)患者開始阿德福韋酯治療前不存在阿德福韋酯相關(guān)耐藥突變。(3)應(yīng)用阿德福韋酯治療后曾出現(xiàn)HBV DNA轉(zhuǎn)陰或HBV DNA下降＞2log拷貝/ml，但在繼續(xù)治療過程中，HBV DNA升高＞1log拷貝/ml，或HBV DNA反跳至1×105拷貝/ml以上。(4)伴有或不伴丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)升高。(5)排除阿德福韋酯治療過程中患者依從性差而引起的乙型肝炎病毒學(xué)突破。(6)排除其他原因引起的ALT升高。對于符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者，在獲取知情同意后留取血清標(biāo)本，保存于－70℃冰箱內(nèi)待測。

1．2 檢測方法

1．2．1 檢測指標(biāo):采用羅氏cobas e601電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測血清HBsAg含量(試劑為羅氏診斷HBsAgⅡ檢測試劑);采用ABI7300實時熒光定量PCR儀進行血清HBV DNA定量檢測(試劑購自中山醫(yī)科大學(xué)達安基因診斷中心)，最低檢測下線為500拷貝/ml;采用美國雅培C8000全自動生化分析儀檢測血清ALT。

1．2．2 HBV DNA測序:所有患者開始阿德福韋酯治療前、出現(xiàn)阿德福韋酯耐藥后均采用美國貝克曼CEQ8000進行HBV P區(qū)基因測序，試劑購自上海翼和生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照說明書進行操作。

1．3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 42例患者發(fā)生阿德福韋酯耐藥后各耐藥位點的變異情況

發(fā)生rtA181位點突變27例，其中單純rtA181變異9例，rtA181野生株和rtA181變異株混合18例;rtN236位點突變6例，其中單純rtN236變異4例，rtN236野生株和rtN236變異株混合2例。見表1。

表1 阿德福韋酯耐藥相關(guān)變異分析 例

2．2 阿德福韋酯耐藥各變異組間病毒學(xué)特點 單純rtA181變異組血清表面抗原明顯低于單純rtN236變異組和rtA181+rtN236變異組(P=0．04);rtA181+rtN236變異組血清HBVDNA和ALT明顯高于單純rtA181變異組和單純rtN236變異組(P=0．03，0．04)。見表 2。

2．3 阿德福韋酯耐藥慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析 采用基因測序的方法，所有阿德福韋酯耐藥慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型中只有3例是B型，而且這3例均在單純N236變異組，其他均為C型。

表2阿德福韋酯耐藥各變異組間病毒學(xué)特點±s

表2阿德福韋酯耐藥各變異組間病毒學(xué)特點±s

注:與 rtA81 比較，*P ＜0．05

項目 表面抗原(S/CO)HBVDNA(log10拷貝/ml)ALT(U/L)rtA181變異3 685 ±986 4．98 ±1．56 49 ±12 rtN236變異 5 462±1 012* 4．12±1．27 56±15 rtA181+rtN236變異 4 714±1 004 6．01±2．07* 87±24*

3 討論

HBV基因組由3 200個堿基對構(gòu)成的部分雙鏈環(huán)狀DNA，含有4個開放讀碼框架，即S、P、C、X區(qū)，其中P區(qū)是編碼HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)域，也是目前常用核苷類似物藥物作用的區(qū)域。RT區(qū)又包括7個功能亞區(qū)，從rt區(qū)上游第1個氨基酸起依次為 A、B、C、D、E、F、G 亞區(qū)，rtN236 位點位于 D 亞區(qū)，rtA181 位點位于B亞區(qū)。Warner等［3］通過體外實驗研究認(rèn)為，HBV rt區(qū)A181T突變反映到S基因上可以引起172位原來編碼色氨酸(W)的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，即sW172* 突變，導(dǎo)致HBsAg丟失大部分C末端疏水區(qū)，從而抑制HBsAg的分泌。本研究結(jié)果顯示單純rtA181變異組血清表面抗原明顯低于單純rtN236變異組和rtA181+rtN236變異組(P=0．04)，這一結(jié)果也與王春亞等［4］研究一致。HBV rt區(qū)A181T突變還會引起病毒在肝細(xì)胞內(nèi)的積聚和HBV DNA載量的下降，這將影響臨床上僅僅依據(jù)血清HBV DNA水平診斷病毒學(xué)突破的結(jié)果［3］。本研究結(jié)果顯示rtA181+rtN236變異組血清HBVDNA和ALT明顯高于單純rtA181變異組和單純rtN236變異組，這一結(jié)果與趙攀等［5］研究一致。rtN236突變與rtA181突變互為補償突變，一種突變可以增強另一種突變的病毒復(fù)制力和適應(yīng)能力，而且rtN236T與rtA181T聯(lián)合突變導(dǎo)致患者血清ALT升高，這會引起肝臟炎癥的波動。體外藥敏實驗表明rtN236T單獨突變可使HBV對阿德福韋的敏感性下降7倍，而rtN236T+rtA181T聯(lián)合突變可使藥物敏感性下降18倍［6］。

在HBV基因型構(gòu)成方面，本研究顯示，B型與C型相比較，B型容易發(fā)生rtN236T單獨突變，本研究結(jié)果顯示有3例是B型，而且這3例均在單純N236變異組，這一結(jié)果與劉峰等［7］的研究結(jié)果一致;阿德福韋耐藥rtN236T突變株與rtA181T突變株有各自的臨床特點，在平時的檢測和診斷中應(yīng)引起足夠重視。

1 秦艷麗，張繼明，黃玉仙，等．阿德福韋治療拉米夫定耐藥慢性乙型肝炎患者的耐藥率及耐藥株進化情況．中華肝臟病雜志，2007，15:4-7．

2 中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會．病毒性肝炎防治方案．中華傳染病雜志，2001，19:56-62．

3 Warner N，Locarnini S．The antiviral drug selected hepatitis B virus rtA181T/sW 172* mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound．H epatology，2008，48:88-98．

4 王春亞，鐘彥偉，楊昊臻，等．HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)N236T突變與A181T突變患者臨床特征的比較．實用醫(yī)院臨床雜志，2010，7:47-48．

5 趙攀，徐東平，李曉東，等．乙型肝炎病逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)N236T單獨突變與N236T+A181T聯(lián)合突變患者臨床特征的比較．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，31:834-836．

6 Bartholomcusz A，Locarnini S．Antiviral drug resistance:clinical consequences and molecular aspects．Semin Liver Dis，2006，26:1621-1670．

7 劉峰，王磊，王麗娜，等．阿德福韋治療慢性乙型肝炎過程中發(fā)生病毒突破患者(HBV)P基因變異分析．山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，46:407-410．