劉學(xué)紅, 張 泳

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院 1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,浙江 紹興 312000)

1000-4718(2012)03-0553-03

2011-08-29

2011-12-31

浙江省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.Y201018535)；紹興文理學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2010LG1011)

△通訊作者 Tel:0575-88345099； E-mail:lxh6588@yahoo.com.cn

微管相關(guān)蛋白2和巢蛋白在人胚胎小腸中的表達(dá)*

劉學(xué)紅1△, 張 泳2

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,浙江 紹興 312000)

目的探討微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)和巢蛋白(nestin)與人胚胎小腸壁組織發(fā)育的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)PV法和圖像分析(NIS-DR)軟件檢測(cè)第2、3、4個(gè)月齡段，人胚胎小腸組織內(nèi)MAP-2和nestin的表達(dá)分布規(guī)律，數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果第2、3、4個(gè)月齡段，MAP-2主要表達(dá)于人胚胎小腸壁黏膜下和肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞和纖維，隨胎齡的增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度增強(qiáng), 兩兩比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Nestin蛋白在小腸壁各層均有陽(yáng)性表達(dá)，其黏膜下層和肌間神經(jīng)叢內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨胎齡增大而呈先增高再降低的趨勢(shì)，兩兩比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論MAP-2和nestin參與調(diào)節(jié)人胚胎小腸壁組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

小腸； 微管相關(guān)蛋白2； 巢蛋白； 人胚胎

巢蛋白(nestin) 和微管相關(guān)蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2)均屬于細(xì)胞骨架蛋白，其表達(dá)分布規(guī)律反映細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)發(fā)育及增殖能力。目前微管蛋白和巢蛋白在動(dòng)物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的分布及病理作用機(jī)制研究較多[1-4]，但關(guān)于它們?cè)谌伺咛バ∧c壁發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)、分布規(guī)律國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本文通過(guò)研究人胚胎小腸壁組織細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中微管蛋白和巢蛋白的表達(dá)狀況，探討兩者在小腸壁組織細(xì)胞分化、發(fā)育過(guò)程中的分布規(guī)律及其作用，為先天性小腸疾病研究提供形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1胚胎收集與分組

收集因意外原因造成人工流產(chǎn)、發(fā)育正常的人胚胎標(biāo)本16例(每例標(biāo)本均取得產(chǎn)婦本人同意和院倫理委員會(huì)審批)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)、B超所測(cè)胎兒雙頂徑和人胚胎形態(tài)學(xué)特征等確定胎齡為7～16周。以每4周為一月齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下：第2個(gè)月齡組5例，第3個(gè)月齡組6例，第4個(gè)月齡5例。

2取材和免疫組織化學(xué)染色程序

從胎尸內(nèi)取出小腸標(biāo)本，分別從每例標(biāo)本中切取腸管長(zhǎng)約1.0 cm，用4 ℃生理鹽水沖洗腸管，放入10%的中性甲醛水溶液中固定12 h后，取出流水沖洗30 min，行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片，片厚4 μm，每個(gè)標(biāo)本取4片，行免疫組織化學(xué)染色(所用試劑MAP-2和nestin Ⅰ抗(小鼠抗人)及其輔助試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。免疫組化染色采用PV法：即切片常規(guī)脫蠟至水→微波抗原修復(fù)→3%H2O2滅活內(nèi)源性酶→滴加Ⅰ抗(抗體濃度為1∶150)→PV6002→DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5 min×3次)→蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

3對(duì)照實(shí)驗(yàn)

用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。

4圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

切片經(jīng)染色后，MAP-2和nestin陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈淡黃色、黃色或深黃色，細(xì)胞核不著色。第2～4月齡段，nestin蛋白在小腸絨毛間質(zhì)細(xì)胞、黏膜下及肌層血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，黏膜上皮和腸腺呈陰性表達(dá)，見圖1。隨著胎齡的增大，黏膜下層及肌間神經(jīng)叢內(nèi)nestin蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量呈先增高再降低的趨勢(shì),其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

MAP-2主要表達(dá)于人胚胎小腸壁黏膜下和肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和它們相連的神經(jīng)纖維,見圖2。隨胎齡的增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度增強(qiáng), 其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

Figure 1. Expression of nestin protein in the small intestinal intermuscular nerve plexus and submucosal plexus at the 2nd to 4th months of fetal age(immunohistochemical staining,×400)↑:positive expression.A: 2 months; B:3 months; C:4 months.

圖1人胎第2～4個(gè)月齡時(shí)，巢蛋白在黏膜下和肌間神經(jīng)叢中的表達(dá)

Figure 2. The MAP-2 expression in the small intestinal intermusculer nerve plexus at the 2nd to 4th months of fetal age(immunohistochemical staining, ×400).↑:intensively positive expression.A:2 months; B: 3 months; C:4 months.

圖2人胎第2～4個(gè)月齡時(shí)，MAP-2蛋白在小腸肌間神經(jīng)叢中的表達(dá)

討 論

在人胚胎形成的第7周，小腸由中腸發(fā)育、分化、演變而成，此期，小腸四層結(jié)構(gòu)已形成。正常小孩和成人胃腸道內(nèi)存在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，俗稱胃腸小腦，它作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，調(diào)控胃腸道正常蠕動(dòng)等各種生理功能。目前臨床許多難治性胃腸功能紊亂性疾病均與胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)異常有關(guān)。研究胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、演變規(guī)律，對(duì)深入研究胃腸道神經(jīng)功能失調(diào)及先天發(fā)育異常具有重要意義。據(jù)報(bào)道，巢蛋白為第Ⅵ類中間絲蛋白,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織器官發(fā)生，代表干細(xì)胞增殖、遷移、分化的特性，是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，被廣泛用于研究人和哺乳動(dòng)物中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育及演變規(guī)律[5-9]。MAP-2是細(xì)胞骨架系統(tǒng)重要成分之一 ，主要存在于神經(jīng)元的胞體和突起中。MAP-2在神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育、突起的形成和生長(zhǎng)、細(xì)胞器運(yùn)輸及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起到重要作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第2～4月齡段，nestin蛋白在小腸絨毛間質(zhì)、黏膜下及肌層血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá)，黏膜上皮和腸腺呈陰性表達(dá)。隨著胎齡的增大，黏膜下層及肌間神經(jīng)叢內(nèi)nestin蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量呈先增高再降低的趨勢(shì)。MAP-2主要表達(dá)于人胚胎小腸壁黏膜下和肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和它們相連的神經(jīng)纖維。隨胎齡的增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度增強(qiáng)。這說(shuō)明在胚胎發(fā)育的早期階段，小腸壁在2個(gè)月齡尚處于生長(zhǎng)發(fā)育形成期，腸壁組織細(xì)胞生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，大部分細(xì)胞在此期處于靜止期，細(xì)胞積蓄能量，為第3個(gè)月齡段小腸壁組織的快速增長(zhǎng)做準(zhǔn)備。到了第3個(gè)月齡段，小腸為適應(yīng)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的需要，生長(zhǎng)速度較前明顯加快，腸壁組織細(xì)胞大量增殖，腸壁內(nèi)大量血管和神經(jīng)細(xì)胞形成和增生，為滿足小腸壁增厚、增長(zhǎng)的生理需要提供營(yíng)養(yǎng)和信息保障。此期，腸壁內(nèi)原先處于靜止期的干細(xì)胞進(jìn)入增殖、分化階段，使巢蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較前增多。隨著胎齡增大，第3個(gè)月齡段腸壁組織細(xì)胞的快速增殖，到了第4個(gè)月齡，小腸壁大部分組織細(xì)胞發(fā)育接近成熟，細(xì)胞骨架成分基本發(fā)育完善，肌細(xì)胞也由活躍的增殖期逐漸轉(zhuǎn)為靜止期，細(xì)胞增殖能力下降，nestin表達(dá)趨于減弱，甚至消失，而MAP-2陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)。這與nestin和MAP-2的生物學(xué)特性有關(guān)，即巢蛋白在干細(xì)胞中的表達(dá)通常為一過(guò)性, 當(dāng)組織分化成熟時(shí), 巢蛋白的表達(dá)即消失。而MAP-2則是神經(jīng)元成熟發(fā)育的重要標(biāo)志物之一，其陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度反映神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育成熟度和細(xì)胞內(nèi)微管組裝活動(dòng)度。錢軍等[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)MAP-2的高表達(dá)可能在脊髓損傷后突觸結(jié)構(gòu)的重建及受損神經(jīng)功能代償和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。Cantarero等[13]報(bào)道nestin在大鼠十二指腸壁的表達(dá)分布規(guī)律與本研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明人和大鼠腸壁干細(xì)胞的分化發(fā)育機(jī)理存在一致性。

表1Nestin在第2～4個(gè)月齡段人胚胎小腸黏膜下層及肌間神經(jīng)叢內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

GroupnNestinpositivecellcount2months520.0000±7.6594*3months638.1304±14.95844months532.9375±10.0696*

*P<0.05vs3 months.

表2MAP-2在第2～4個(gè)月齡段人胚胎小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度

GroupnMAP-2positivecellintensity2months590.7888±9.4122*3months691.2775±3.565304months596.9577±4.4002*

*P<0.05vs3 months.

因此，我們認(rèn)為在人胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，MAP-2和nestin參與了調(diào)控小腸壁組織細(xì)胞分化、發(fā)育過(guò)程。

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Expressionofmicrotubule-associatedprotein2andnestininsmallintestinetissuesofhumanembryos

LIU Xue-hong1, ZHANG Yong2

(1DepartmentofHistologyandEmbryology,2MedicalLaboratoryCenter,MedicalCollege,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:lxh6588@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the relationship between expression of microtubule-associated protein 2 (MAP-2)/nestin and development of small intestine in human embryos.METHODSThe expression of MAP-2 and nestin proteins was detected in the second, third and fourth months of fetal human embryonic small intestinal tissues by the PV method of immunohistochemistry. The positive cell counts and positive intensities were analyzed with Nikon imaging system (NIS-DR). One-way ANOVA was applied to compare these positive cell counts and positive intensities.RESULTSAt the second, the third and the fourth month of human embryos, MAP-2 positive expression was observed in the neural cells and neural fibers of the intermuscular nerve plexus and submucosal plexus in the developing small intestines. With the fetal age increasing, the expressive intensity of MAP-2 positive cells in the neural tissues of the intermuscular nerve plexus showed an uptrend. The results of positive intensity values of the MAP-2 positive cells detected in the 3 fetal age periods showed significant difference (P<0.05). Nestin positive expression was seen in all layers of the small intestine, and the number of positive cells was first increased and then decreased in the developing small intestines of human embryos with the increasing fetal age. One-way ANOVA results also showed significant difference (P<0.05).CONCLUSIONMAP-2 and nestin regulate the development of small intestinal tissues in human embryos.

Intestine, small; Microtubule-associated protein 2; Nestin; Human embryo

R329.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.031