吳漢青 王博 范平 吳河水

·論著·

Toll樣受體9和低氧誘導因子1α在胰腺癌中的表達及其意義

吳漢青 王博 范平 吳河水

目的研究Toll樣受體9(TLR9)和低氧誘導因子1α(HIF-1α)在胰腺癌組織中的表達，探討其臨床意義。方法采用實時定量PCR法、蛋白質(zhì)印跡法及免疫組織化學法檢測30例胰腺癌組織及其相鄰癌旁組織、10例正常胰腺組織中TLR9和HIF-1α的表達，分析兩者表達的相關(guān)性、與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系以及對患者生存時間的影響。結(jié)果胰腺癌TLR9 mRNA及HIF-1αmRNA表達量分別為正常胰腺組織的2.32(1. 41～3.22)倍和2.26(1.62～2.89)倍，癌旁組織表達量分別為正常胰腺組織的1.23(1.18～1.28)倍和1.36(1.17～1.55)倍，胰腺癌的表達量顯著高于癌旁組織(t=2.642,P=0.023；t=4.076,P=0.001)。胰腺癌組織TLR9和HIF-1α蛋白陽性表達率分別為73.3%(22/30)和70.0%(21/30)，癌旁組織分別為33.3%(10/30)和36.7%(11/30)，正常胰腺組織分別為20%(2/10)和10%(1/10)，呈遞減趨勢(χ2=13.99,P=0.001；χ2=13.15，P=0.001)。胰腺癌組織TLR9 mRNA與HIF-1α mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.537，P=0.003)，TLR9和HIF-1α蛋白陽性表達率亦呈正相關(guān)(r=0.511，P=0.001)。胰腺癌組織TLR9和HIF-1α表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者的生存時間呈負相關(guān)。結(jié)論胰腺癌組織TLR9和HIF-1α基因均高表達，且與腫瘤細胞的惡性生物學行為及患者預后差有關(guān)。

胰腺腫瘤； Toll樣受體9； 低氧誘導因子1α

Toll樣受體9(Toll-like receptor，TLR9)為TLR家族重要成員，能夠刺激B細胞和樹突狀細胞分泌大量的細胞因子和趨化因子，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[1]。TLR9不僅表達于免疫細胞，也表達于多種腫瘤細胞[2]。低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是最重要的低氧信號傳遞因子，調(diào)控一系列促進血管生成、細胞存活、糖酵解、細胞增殖、腫瘤浸潤的基因表達[3]。本研究檢測胰腺癌組織TLR9和HIF-1α的表達，探討它們在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

資料與方法

一、臨床資料

收集華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心2008年12月至2010年8月接受手術(shù)治療并經(jīng)病理證實的30例胰腺癌組織及距腫瘤邊緣1～2 cm處的癌旁胰腺組織。10例正常胰腺組織標本取自其他原因需行胰腺部分切除的非腫瘤患者，且經(jīng)術(shù)后病理證實。40例患者中男19例，女11例；年齡39～75歲，平均57歲。30例胰腺癌患者術(shù)前均未行放療及化療，術(shù)后常規(guī)化療，定期隨訪，隨訪截止日期為2011年12月31日。28例獲得完整隨訪，失訪2例。

二、TLR9、HIF-1α mRNA檢測

參照Trizol試劑盒(Sigma公司)說明書提取組織總RNA。根據(jù)GenBank人TLR9 mRNA設(shè)計引物序列。TLR9上游為5′-GCCCAAATCCCTCATATCCC-3′，下游為：5′-AACAGTTGCCGTCCATGAATAG-3′，擴增產(chǎn)物113 bp；HIF-1α上游為5′-TGAAGT-GTACCCTAACTAGCCG-3′，下游為5′-AATCAGCACCAAGCAGGTCATAG-3′，擴增產(chǎn)物158 bp。內(nèi)參β-actin上游為5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游為5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，擴增產(chǎn)物190 bp。引物由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用ReverTra Ace(Toyobo公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實時PCR檢測TLR9、HIF-1α mRNA。反應(yīng)程序：50℃ 2 min，95℃ 2 min，然后95℃ 15 s，58℃ 15 s， 72℃ 45 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。通過PCR儀(HONGSHI公司)自帶軟件獲取檢測樣本的△CT(CT目的基因-CTβ-actin),以10例正常胰腺組織的△CT均值作為對照，計算△△CT(△CT癌或癌旁組織-△CT對照組織)，通過公式2-△△CT計算mRNA擴增倍數(shù)。

三、TLR9、HIF-1α蛋白檢測

常規(guī)提取組織蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測TLR9、HIF-1α蛋白表達。兔抗人TLR9單抗1∶750稀釋，鼠抗人HIF-lα單抗(cell signaling公司)1∶500稀釋。最后ECL發(fā)光，X膠片曝光、顯影、定影。采用自動電泳凝膠成像分析軟件(Band scan v5.0)進行圖像掃描和分析。

對固定的組織常規(guī)包埋、切片，采用免疫組織化學試劑盒(武漢博士德公司)檢測TLR9和HIF-1α，按說明書操作。用PBS代替一抗作為陰性對照。細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。由病理科醫(yī)師雙盲法閱片，根據(jù)著色強度和陽性細胞百分比進行半定量分析。無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；無陽性細胞為0分，陽性細胞<25%為1分，25%～49%為2分，≥50%為3分。兩個分值相加，0～3分為低表達，≥4分為高表達。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、TLR9、HIF-1α mRNA表達

正常胰腺組織TLR9、HIF-1α mRNA低表達。胰腺癌及癌旁組織TLR9 mRNA的表達量分別是正常胰腺組織的2.32(1.41～3.22)倍及1.23(1.18～1.28)倍； HIF-1α mRNA的表達量分別是正常胰腺組織的2.26(1.62～2.89)倍及1.36(1.17～1.55)倍。胰腺癌組織的表達均顯著高于癌旁組織(t=2.642，P=0.023；t=4.076,P=0.001)。胰腺癌組織TLR9 mRNA與HIF-lα mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.537，P=0.003)。

二、TLR9、HIF-1α蛋白表達

蛋白質(zhì)印跡法顯示，胰腺癌、癌旁組織、正常胰腺組織TLR9蛋白表達量分別為0.815±0.092、0.511±0.067、0.133±0.076；HIF-1α蛋白表達量分別為0.923±0.084、0.413±0.077、0.112±0.059。癌組織的表達量顯著高于癌旁組織及正常胰腺組織(圖1)。

圖1 TLR9及HIF-1α蛋白表達

免疫組化法顯示，TLR9蛋白主要表達于癌細胞的胞質(zhì)內(nèi)，HIF-1α蛋白表達于胞質(zhì)和胞核。癌旁及正常胰腺組織見少量胰腺腺泡細胞TLR9及HIF-1α蛋白弱表達 (圖2)。正常胰腺組織、胰腺癌旁組織和胰腺癌組織的TLR9陽性表達率分別為20%(2/10)、33.3%(10/30)和73.3%(22/30)；HIF-1α陽性表達率分別為10%(1/10)、36.7%(11/30)和70.0%(21/30)。從正常、癌旁到胰腺癌組織，TLR9及HIF-1α的陽性表達率呈遞增趨勢，各組間差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為13.99、13.15，P=0.001)。在胰腺癌組織中，TLR9和HIF-1α蛋白陽性表達率呈正相關(guān)(r=0.511，P=0.001)。

圖2TLR9(上)及HIF-1α(下)在胰腺癌組織(a)、癌旁組織(b)及正常胰腺組織(c)中的表達(免疫組化 ×200)

三、TLR9、HIF-1α表達與臨床病理特征的關(guān)系

TLR9、HIF-1α的表達與腫瘤部位及腫瘤大小無關(guān)(P值均>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和臨床TNM分期有關(guān)(P值均<0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織中TLR9及HIF-1α的表達與臨床病理特征的關(guān)系

四、TLR9、HIF-1α表達與患者生存時間的關(guān)系

TLR9陽性患者平均生存期為14.5個月(95%可信區(qū)間13.7～15.4)；陰性患者平均為21.5個月(95%可信區(qū)間20.2～22.9)，顯著長于陽性患者(χ2=16.89，P<0.05，圖3)。HIF-1α陽性患者平均生存期為14.8個月(95%可信區(qū)間13.8～15.8)；陰性患者平均為21.8個月(95%可信區(qū)間20.3～23.4)，生存期顯著長于陽性患者(χ2=17.55，P<0.05，圖3)。

圖3TLR9及HIF-1α表達陽性及陰性患者的生存曲線

討 論

1997年Medzhitov等首次發(fā)現(xiàn)了人類的第一種Toll同源變體(即TLR4)，后又發(fā)現(xiàn)并確認了10種人的TLR家族蛋白，分別命名為TLR1～TLR11。TLR9特異性識別的病原體相關(guān)分子模式為細菌和病毒DNA中的CpG序列或人工合成的寡脫氧核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotides)[2]，在介導外源CpG DNA激活先天免疫過程中有重要的生物學意義。TLR9除了抗感染作用，還與自身免疫紊亂及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[4-5]。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織、癌旁胰腺組織及正常組織中均有TLR9 mRNA和蛋白的表達，但癌組織的表達最高，與Droemann等[6]在肺癌中的研究結(jié)果一致。胰腺癌組織中TLR9的高表達與腫瘤分化程度、TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠距離轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TLR9參與胰腺組織的惡性轉(zhuǎn)化過程。患者生存期分析結(jié)果還顯示，TLR9陰性表達患者的生存時間顯著長于陽性表達患者，推測胰腺癌TLR9信號通路的激活可促進癌細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，進而影響患者預后。

浸潤性生長的腫瘤常缺乏足夠的血供，在距離血管較遠的腫瘤組織區(qū)域形成不同程度的低氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及代謝產(chǎn)物堆積[7]。腫瘤缺細胞感知周圍的低氧環(huán)境，調(diào)節(jié)代謝以適應(yīng)受限的氧供給，最重要的機制就是HIF-1α的活化，本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織HIF-1α mRNA和蛋白高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)，且與患者預后差有關(guān)，與Sun等[8]和Kitada等[9]研究結(jié)果一致。提示胰腺癌中存在HIF-1α的高表達，并與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性表型相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，胰腺癌組織TLR9和HIF-1α的表達呈正相關(guān)，表明TLR9信號通路和HIF-1α信號通路可能存在交叉，但具體的聯(lián)系機制目前尚不明確。最初的研究認為，HIF-1α僅對低氧發(fā)生反應(yīng)，但最近研究發(fā)現(xiàn)它也能受到諸如癌基因激活、腫瘤抑制基因失活等的調(diào)控。而且組織微環(huán)境內(nèi)糖及氧代謝產(chǎn)物的增加也能穩(wěn)定HIF-1α，這些腫瘤組織的遺傳和生理的改變導致HIF-1活化[10]。因此推測在胰腺癌微環(huán)境內(nèi)，由于組織缺血壞死等因素，壞死組織和細胞釋放出熱休克蛋白以及基質(zhì)降解等產(chǎn)生多種TLR9內(nèi)源性配體，持續(xù)激活TLR9信號通路，進而通過某種機制進一步活化HIF-1α，共同促進了胰腺癌的惡性進展。

[1] Jurk M, Vollmer J. Therapeutic applications of synthetic CpG oligodeoxynucleotides as TLR9 agonists for immune modulation. Bio Drugs, 2007, 21:387-401.

[2] Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature, 2000, 408:740-745.

[3] Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy．Nat Rev Cancer，2003, 3:721-732．

[4] Ishii KJ, Akira S. Innate immune recognition of, and regulation by, DNA. Trends Immunol, 2006, 27:525-532.

[5] Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature, 2002, 420: 860-867.

[6] Droemann D,Albrecht D,Gerdes J,et al.Human lung cancer cells express functionally active Toll-like receptor 9.Respir Res,2005,6:1.

[7] Milosevic M,Fyles A,Hedley D,et al.The human tumor microenvironment:invasive(needle) measurement of oxygen and interstitial fluid pressure.Semin Radiat Oncol,2004,14:249-258．

[8] Sun HC, Qiu ZJ, Liu J, et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha and associated proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma and their impact on prognosis．Int J Oncol，2007, 30:1359-1367.

[9] Kitada T, Seki S, Sakaguchi H, et al．Clinicopathological significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha expression in human pancreatic carcinoma．Histopathology,2003,43:550-555.

[10] Denko NC．Hypoxia，HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour．Nat Rev Cancer，2008,8:705-713.

ExpressionandsignificanceofTLR9andHIF-1αinpancreaticcancer

WUHan-qing,WANGBo,FAN-ping,WUHe-shui.

DepartmentofEmergencySurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WUHan-qing,Email:wuhanqincat@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of toll-like receptor 9 (TLR9) and hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) in pancreatic cancer.MethodsThe real-time RT-PCR technique, western blot method and immunohistochemical method were used to examine the expressions of TLR9 and HIF-1α in 30 samples of pancreatic cancer, para-cancerous tissues, and 10 samples of normal pancreatic tissues. The relationship between TLR9 and HIF-1α was determined, and the correlations between their expressions and clinicopathological parameters were measured, and the impact on survival was detected.ResultsThe levels of TLR9 mRNA and HIF-1α mRNA expression in human pancreatic cancer tissues was 2.32(1.41～3.22) and 2.26(1.62～2.89) folds as many as that in normal tissues. The levels of TLR9 mRNA and HIF-1α mRNA expression in para-cancerous tissues were 1.23(1.18～1.28) and 1.36(1.17～1.55) folds as many as that in normal tissues. The expressions in human pancreatic cancer tissues were significantly higher than those in para-cancerous tissues (t=2.642,P=0.023;t=4.076,P=0.001). The positive rates of TLR9 and HIF 1α protein were 73.3%(22/30) and 70.0%(21/30), and the corresponding values were 33.3%(10/30) and 36.7%(11/30) in para-cancerous tissues, while the corresponding values were 20%(2/10) and 10% (1/10) in normal tissues, which showed a decreasing trend (χ2=13.99,P=0.001;χ2=13.15,P=0.001). The expressions of TLR9 mRNA in human pancreatic cancer tissues was positively associated with HIF 1α mRNA (r=0.537,P=0.003). The expressions of TLR9 protein was also positively associated with HIF 1α protein (r=0.511,P=0.001). The expressions of TLR9 and HIF 1α were positively correlated with the degree of tumor differentiation, TNM staging and lymph node metastasis, but were negatively correlated with the survival.ConclusionsTLR9 and HIF-1α are over-expressed in pancreatic cancer and they are associated with malignant biological behavior and poor prognosis.

Pancreatic neoplasms; Toll-like receptor 9; Hypoxia-inducible factor 1α

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.008

國家自然科學基金(30200272)

430022 湖北武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院急診外科(吳漢青)，胰腺外科(王博、范平、吳河水)

吳漢青，Email:wuhanqincat@163.com

2012-08-28)

(本文編輯：呂芳萍)