樊 昕，任曉萍，李海濤，楊蓉婭

（北京軍區(qū)總醫(yī)院 全軍皮膚病診治中心，北京100125）

殼聚糖（Chitosan）是由葡糖胺和N－乙?；咸前窐嫵傻纳锕簿畚?，經(jīng)天然生物大分子甲殼素脫乙酰基轉化而來，其結構類似糖胺聚糖（glyeosaminoglycans，GAGs），具有良好的生物相容性、生物可降解性以及抗菌消炎、止血促愈等生理功能，是優(yōu)異的醫(yī)用敷料及組織工程材料［1］。但是殼聚糖是否會影響真菌生物被膜（fungus biofilm）的形成尚未見相關報道。本實驗應用不同濃度殼聚糖觀察其對阿薩希毛孢子菌生物被膜（T.asahii BF）形成的影響，為臨床研究調控真菌生物被膜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：阿薩希毛孢子菌株1株，來源于本院皮膚科臨床分離株（BZP07002），并經(jīng)API20AUX生化鑒定及 DNA 序列分析驗證（AS2.2174）［2］

主要試劑及材料：RPMI 1640培養(yǎng)基和殼聚糖購自美國Sigma公司，XTT試劑購自美國Appli－Chem公司，PMS購自Sigma公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，全自動酶聯(lián)免疫測定儀購自美國Bio－rad公司。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜體外構建 將－80℃保存的阿薩希毛孢子菌菌種復蘇，在沙氏培養(yǎng)基中轉種培養(yǎng)2次，轉入酵母蛋白胨葡萄糖肉湯（YPD）中過夜振蕩培養(yǎng)，離心、收集后，重懸于RPMI－1640中，稀釋成106CFU∕ml菌懸液。在培養(yǎng)板中預先放入無菌的聚苯乙烯（長寬各為1.0 cm）。將2 ml該菌懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，選擇30℃培養(yǎng)48－72 h。2 h時PBS緩沖液沖洗2次，重新加入2.0 ml RPMI－1640培養(yǎng)液。之后每隔24 h更換一次培養(yǎng)液。設不加有阿薩希毛孢子菌的空白對照組。

1.2.2 生物被膜形成的定量分析 通過XTT還原比色測定法進行定量分析。測定依據(jù)通過代謝活性細胞使黃色的四唑鹽XTT分裂成橘黃色的甲臜染料。RPMI 1640培養(yǎng)液中加入XTT和電子耦合劑PMS使終濃度為12.5μmol／L。在預先洗滌培養(yǎng)的生物膜孔和空白對照孔中放入1.5 ml的XTTPMS溶液，30℃避光培養(yǎng)2 h。離心上清液平分在96孔板中，微量滴定板492 nm下讀數(shù)。同時將含有生物被膜的聚苯乙烯材料放入YPD液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48 h，通過細胞計數(shù)板計數(shù)評估總的活菌數(shù)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察 將已構建生物被膜的聚苯乙烯用滅菌的PBS緩沖液沖洗2次，放置在載玻片上倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 殼聚糖的配制 稱取一定量的殼聚糖，用1%冰醋酸溶解后，無菌水稀釋配制0.25 mg／m L，0.50 mg／m L，0.75 mg／m L，1.0 mg／m L，1.25 mg／m L和1.5 mg／m L殼聚糖溶液，將生物材料放入配制殼聚糖溶液5 ml中32℃孵育，分別在生物膜模型放入前（0 h）和模型放入后第48 h和96 h進行倒置顯微鏡觀察和XTT定量分析。

1.2.5 不同濃度殼聚糖對生物被膜作用的吸光度檢測：取菌懸液50μl加入含有不同濃度殼聚糖150 μl／孔的96孔板培養(yǎng)；實驗過程中每組做3個平行孔，重復3次實驗，以不含菌懸液的孔作為基線對照；48－72 h取出相應的96孔板。吸出孔內(nèi)菌懸液，PBS清洗孔3次去除浮游細菌，微孔板在室溫下干燥30 min；加入1%Crystal Violet200μl／孔染色，放置20 min后吸出染液，PBS清洗孔3次去除孔壁染液，微孔板在室溫下干燥30 min；加入95%乙醇200μl／孔微量振蕩器上震蕩30 min復吸染液，復吸液放入一新的96孔微孔板中；全自動酶聯(lián)免疫儀測定630 nm處的吸光（OD）值，并繪制曲線。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。采用單因素方差分析（F）和LSD－t檢驗進行多個樣本均數(shù)的兩兩比較。取α＝0.01為檢驗水準，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

用全自動酶聯(lián)免疫測定儀630 nm可見光測定阿薩希毛孢子菌生物膜OD值時發(fā)現(xiàn)，48 h內(nèi)0.25 mg／m L，0.5 mg／m L，0.75 mg／m L和1.0 mg／m L殼聚糖溶液沒有明顯抑制生物膜形成的作用；1.25 mg／m L殼聚糖溶液明顯具有抑制T.asahiiBF形成的作用，菌體均處于浮游狀態(tài)，小部分形成團塊，60 h后逐漸形成生物膜結構但是結構松散，96 h后逐漸消失抑制作用，但XTT值和活菌數(shù)均小于正常T.asahiiBF形成的數(shù)值。（見表1，圖1，2）

表1 1.25 mg／mL殼聚糖對T.asahii BF的定量 XTT測定（x－±S）和活菌計數(shù)

圖1 1.25 mg／m L殼聚糖對T.asahii BF的定量XTT測定和活菌計數(shù)

圖2 不同濃度殼聚糖對T.asahii BF形成情況

3 討論

近年來臨床各種醫(yī)用材料的使用率很高，特別是侵入性治療例如體外插管等操作使耐藥真菌數(shù)量及種類迅速增加和出現(xiàn)交叉耐藥［3］，同時各種微生物易于粘附于其表面且可形成生物被膜，導致耐藥性增加而感染灶不易清除［4］。既往我們的研究表明［5，6］：阿薩希毛孢子菌可以形成生物被膜，當生長趨于成熟時，代謝的活性相對穩(wěn)定，但仍保持在一個高水平；生物被膜中存在孔隙結構，活菌圍繞在孔隙周圍并被死菌包裹，使活菌一方面可直接從孔隙中獲得營養(yǎng)，又可抵御環(huán)境中有害物質的破壞。進一步研究我們發(fā)現(xiàn)［7］：不同培養(yǎng)條件下例如培養(yǎng)溫度、p H等會明顯影響生物被膜的生長。

本研究發(fā)現(xiàn)：48 h內(nèi) 0.25 mg／m L，0.5 mg／m L，0.75 mg／m L和1.0 mg／m L殼聚糖溶液沒有明顯抑制生物膜形成的作用，但是生物膜形成總體類似p H偏酸性的表現(xiàn)；1.25 mg／m L殼聚糖溶液明顯具有抑制T.asahii BF形成的作用，菌體均處于浮游狀態(tài)，小部分形成團塊，60 h后逐漸形成生物膜結構但是結構松散，96 h后逐漸消失抑制作用，但XTT值和活菌數(shù)均小于正常T.asahii BF形成的數(shù)值。由于殼聚糖是一種高分子生物材料，現(xiàn)已證實殼聚糖對多種細菌的生長具有抑制作用，表現(xiàn)出類似抗生素的特征。殼聚糖的抗菌作用主要有以下2種機制：大分子殼聚糖通過自身所帶的正電荷與微生物細胞膜所攜帶的負電荷相互作用，破壞細菌細胞壁原有結構，造成細胞成分的泄漏而起到抗菌作用；小分子殼聚糖，通過滲透進入細胞內(nèi)，與帶有陰離子的生物大分子發(fā)生類似“絮凝”作用，擾亂細胞的正常生理功能，從而抑制細菌的繁殖和生長［8］。我們分析殼聚糖具有抑制生物被膜的作用主要是由于本身的電荷與真菌之間的差異性導致真菌代謝異常而呈現(xiàn)低水平增殖活性，其黏附與材料表面的附著力也相應減低或者暫時受到抑制，但是由于殼聚糖抑制真菌作用是有一定時效性，因此時間較長96 h后逐漸失去其抑制生物被膜的作用，但是其具體調控機制尚待進一步深入探討和研究，這也是我們?nèi)蘸箨P注的焦點和研究方向。

本實驗發(fā)現(xiàn)48 h時具有清除作用，而96 h已經(jīng)不能清除真菌，說明殼聚糖清除阿薩希毛孢子菌減少的機制，可能有多種原因：其一是殼聚糖作為多聚陽離子兩性電解質，可以附著于生物膜的底物及真菌表面，改變了兩者的電荷性質，減少了兩者的相互作用和改變了真菌表面的疏水性，從而導致生物膜的脫離；其二是由于殼聚糖滅活真菌后的自然減少［9］。在酸性條件下，殼聚糖分子吸附到真菌細胞壁上，使細胞壁和細胞膜上負電荷分布不均，干擾細胞壁合成，導致細菌裂解而死亡；另一方面殼聚糖進入細胞內(nèi)，與真菌DNA形成穩(wěn)定的復合物，阻礙DNA或RNA的合成，從而抑制真菌的繁殖［10］。我們還認為殼聚糖可能會通過在菌體表面形成保護膜，阻止營養(yǎng)物質的進入來達到抑菌目的。此外我們假設認為殼聚糖可能會直接引起真菌菌絲生長的抑制作用，在調節(jié)菌絲生長中某些重要的抑制與菌絲生長有關的基因，這也是我們今后研究的方向和主要內(nèi)容。

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