王光忠，邵貝貝，鄧媛媛，黃婕，劉焱文

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430061)

RP-HPLC測(cè)定茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量△

王光忠，邵貝貝，鄧媛媛，黃婕，劉焱文*

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430061)

目的建立茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量測(cè)定方法,為該提取物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對(duì)茯苓乙醇提取物中茯苓酸進(jìn)行定性定量分析，利用保留時(shí)間定性和外標(biāo)兩點(diǎn)法定量。結(jié)果此方法線性關(guān)系良好，茯苓酸線性回歸方程為Y=565.41X+14.477(r=0.999 5)，平均回收率為99.76 %，RSD=1.13 %(n=6)。結(jié)論該方法簡便、可靠，可作為茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量測(cè)定方法。

茯苓乙醇提取物；茯苓酸；RP-HPLC；含量分析

茯苓為多孔菌科真菌Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,又名茯菟、茯靈、松薯、松苓等,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品[1]。茯苓味甘、淡、性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)。具有利水滲濕健脾，寧心的功能。用于水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠等的治療[2]。茯苓中主要含有茯苓聚糖、三萜、脂肪酸等成分[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，茯苓三萜為該中藥的重要功效物質(zhì)。茯苓乙醇提取物主要含總?cè)祁愇镔|(zhì)，而茯苓酸為其主要三萜成分[4-5],，具有抗炎[6]、抗腫瘤[7]及集落刺激因子誘生劑[8]等作用。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(RP-HPLC)分析方法，對(duì)茯苓乙醇提取物中的茯苓酸(pachymic acid)進(jìn)行含量分析研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1100 series高效液相色譜儀(G1322A排氣閥，G1311A泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測(cè)器)，Aglient 色譜工作站，C18色譜柱；十萬分之一天平(Sartorius BP211D)；萬分之一天平(Metter Toledo AL204)。

1.2 試藥

茯苓乙醇提取物由本實(shí)驗(yàn)室提供；茯苓酸對(duì)照品為本實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)面積歸一化法測(cè)定后確認(rèn)其純度大于98 %。乙腈為色譜純,水為重蒸餾水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil 100-5C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-0.2 %醋酸(82∶18)；檢測(cè)波長：210 nm，色譜圖見圖1。

圖1 茯苓酸對(duì)照品及茯苓HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取減壓至恒重的茯苓酸對(duì)照品3 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得0.3 mg·mL-1的茯苓酸對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取茯苓乙醇提取物0.25 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，稱定，浸泡30 min，超聲30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，過濾；得續(xù)濾液即為供試品。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取茯苓酸對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，12 μL,注入色譜儀中 ,測(cè)定其峰面積值。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=565.41X+14.477，n=6。結(jié)果表明，茯苓酸在0.6～3.6 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄茯苓酸的峰面積，RSD=0.44 %(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一樣品溶液，分別于0，2，4，8，16 h各進(jìn)樣10 μL，記錄茯苓酸的峰面積，RSD=1.30 %(n=6)，表明樣品溶液在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取茯苓乙醇提取物6份，按樣品含量測(cè)定項(xiàng)下的方法處理，并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明茯苓酸的含量平均為2.72 %，RSD=1.38 %(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量茯苓乙醇提取物樣品6份，每份0.125 g，分別精密加入對(duì)照品3 mg，照供試品溶液的制備方法處理，測(cè)定茯苓酸的含量，平均回收率為99.76 %，RSD=1.13 %，表明該方法可靠性強(qiáng)，結(jié)果見表1。

表1 茯苓酸加樣回收試驗(yàn)

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取071820，071821，071822 3批茯苓乙醇提取物樣品，按供試品制備方法制備溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品溶液中茯苓酸的含量分別為2.67 %，1.60 %，2.77 %。

3 討論

茯苓三萜類成分具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。茯苓藥材的乙醇提取物主要含三萜類成分，總?cè)坪窟_(dá)40 %。本論文采用RP-HPLC分析方法，對(duì)茯苓乙醇提取物中的主要三萜類成分茯苓酸進(jìn)行了分析研究，其研究結(jié)果可望為茯苓三萜有效物質(zhì)部位的開發(fā)利用提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、三氯甲烷3種溶媒的提取效果，以甲醇提取制得樣品的測(cè)定值較高，因此選擇甲醇作為提取溶媒?？疾炝藘煞N溶劑不同比例的洗脫效果，最終選擇乙腈-0.2 %醋酸(82∶18)作為流動(dòng)相。

由方法學(xué)研究結(jié)果和3批樣品的測(cè)定結(jié)果看，本方法線性關(guān)系良好，精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)均符合要求，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量測(cè)定。

[1] 肖培根 新編中藥志[M].III.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002：8901.

[2] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：224.

[3] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草精選本[M].上冊(cè).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:554-554,1871.

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[5] 楊樹東,包海鷹.茯苓中三萜類和多糖類成分的研究進(jìn)展[J].菌物研究,2005,3(3):55-61.

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DeterminationofPachymicAcidinEthanolExtractofPoriacocosbyRP-HPLC

WANG Guang-zhong,SHAO Bei-bei,DENG Yuan-yuan,HUANG Jie,LIU Yan-wen

(KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResourceandCompoundPrescription,HubeiUniversityofTCM,Wuhan430061,China)

Objective: To determine the content of pachymic acid in ethanol extract ofPoriacocosand provide the basis for the effective quality control of the material.MethodsPachymic acid in ethanol extract ofPoriacocosis derterminated by RP-HPLC with the retention time qualitative and external standard method quantitative.ResultsThe linear regression equation isY=565.41X+14.477(r=0.999 5),the average recovery is 99.76 %,RSD=1.13 %(n=6).ConclusionThe method is simple and reliable and can be used as a a quality control for ethanol extract ofPoriacocos.

Ethanol extract ofPoriacocos;Pachymic acid;RP-HPLC;Content analysis

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970295)

*劉焱文，Tel：(027)88920834，E-mail：ywliu2008@163.com

2011-08-10)