鄧龍祥 陳況 葉初陽 王黎平 劉芳娥

睡眠具有維持個(gè)體生存、恢復(fù)體力及精力、促進(jìn)生長發(fā)育、易化學(xué)習(xí)等功能。近年來的研究表明，不同程度的睡眠剝奪可引起機(jī)體免疫力下降、警覺性和判斷力下降、記憶力下降等變化［1］。L-蘋果酸是一種重要的天然有機(jī)酸，廣泛分布于植物、動(dòng)物與微生物細(xì)胞中，其口感接近天然蘋果的酸味［2］。有研究證明L-蘋果酸可以改善腦組織的能量代謝，調(diào)整腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，有利于學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)，對(duì)學(xué)習(xí)記憶有明顯的改善作用［3］。但L-蘋果酸對(duì)睡眠剝奪后大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究L-蘋果酸對(duì)睡眠剝奪后大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，為L-蘋果酸影響學(xué)習(xí)記憶這一理論提供更加全面的依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選用健康成年雄性SD大鼠20只，體重(200±20)g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。經(jīng)Morris水迷宮訓(xùn)練之后，篩選出成績(jī)相近的大鼠16只，隨機(jī)分為2組，每組8只。對(duì)照組:SD+生理鹽水組;實(shí)驗(yàn)組:SD+L-蘋果酸組。

1.2 藥品與儀器 睡眠剝奪裝置(參照文獻(xiàn)［4］自制)，Morris水迷宮(參照文獻(xiàn)［5］自制)，秒表，L-蘋果酸(藥品源自上海源葉生物科技有限公司，純度為99.9%)，灌胃針等。

1.3 給藥 實(shí)驗(yàn)組每日給L-蘋果酸的劑量為10 mg/kg，配置成2 ml的溶液，每天下午17:00灌胃，對(duì)照組在相同的時(shí)間內(nèi)用相同量的生理鹽水進(jìn)行灌胃。1次/d，連續(xù)進(jìn)行7 d，然后給予睡眠剝奪3 d。在睡眠剝奪期間，依然按分組每日給予L-蘋果酸或著生理鹽水。

1.4 睡眠剝奪模型的建立 采用多平臺(tái)水環(huán)境法(modifield multiple platform method)制備大鼠睡眠剝奪模型。使用90 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，其中有一高15 cm，直徑6.3 cm的平臺(tái)。在平臺(tái)的周圍注滿水，水溫保持在20℃左右，水面距平臺(tái)面約1.0 cm。鼠在平臺(tái)上可以自行進(jìn)食飲水。若其睡眠，則由于肌肉張力松弛而落入水中，大鼠只能重新振作精神爬上平臺(tái)，如此反復(fù)達(dá)到睡眠剝奪的效果。睡眠剝奪之前，先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境，時(shí)間為7 d，此期間在給予大鼠L-蘋果酸和生理鹽水灌胃的同時(shí)，將大鼠放在未注水的睡眠剝奪箱內(nèi)，讓其熟悉環(huán)境。在7 d的熟悉環(huán)境之后，即進(jìn)行72 h的睡眠剝奪。

1.5 學(xué)習(xí)記憶的測(cè)試 用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶的訓(xùn)練與測(cè)試。水迷宮為一直徑1m，高50 cm的圓形水池，池內(nèi)水深25 cm，水池按方位平均分為四個(gè)象限，設(shè)定4個(gè)入水點(diǎn)。在一個(gè)象限內(nèi)置一高24 cm的平臺(tái)，平臺(tái)沒于水而下1 cm。水溫保持在20℃左右，平臺(tái)、水、池壁均染成白色以隱蔽平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)過程中水池及周圍環(huán)境保持不變。睡眠剝奪前對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練。訓(xùn)練時(shí)，將大鼠面向池壁從四個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，用秒表記錄大鼠的反應(yīng)時(shí)，即大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需的時(shí)間，用秒(s)表示。大鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立10 s，然后進(jìn)行下一次的訓(xùn)練。每只大鼠從四個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為一輪訓(xùn)練，訓(xùn)練4輪，即訓(xùn)練16次，每次間隔60 s，兩次訓(xùn)練之間間隔30 s。訓(xùn)練成功的標(biāo)志是連續(xù)4次都是60 s內(nèi)找到平臺(tái)并站立于其上。淘汰訓(xùn)練未成功的大鼠，本實(shí)驗(yàn)16只大鼠訓(xùn)練成功，淘汰4只。在睡眠剝奪40h和72 h各進(jìn)行水迷宮測(cè)量一次。測(cè)量時(shí)，將大鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入的反應(yīng)時(shí)(s)取平均數(shù)，作為測(cè)試成績(jī)，若大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則以60 s計(jì)。

2 結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠在水迷宮中的反應(yīng)時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，SD48 h和SD72 h的差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(見表1)。均數(shù)間的多重比較顯示，無論SD48 h還是SD72 h，實(shí)驗(yàn)組的大鼠反應(yīng)時(shí)均較對(duì)照組明顯縮短(P＜0.01)。

表1 各組睡眠剝奪大鼠在水迷宮中的反應(yīng)時(shí)(±s，n=8)

表1 各組睡眠剝奪大鼠在水迷宮中的反應(yīng)時(shí)(±s，n=8)

注:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比P＜0.05，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有意義

時(shí)間 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組48 h 27.94±8.07 14.93±3.89 72 h 27.32±4.30 14.71±4.75

3 討論

已有研究表明，睡眠和記憶有密切關(guān)系［6］，睡眠剝奪對(duì)動(dòng)物的短時(shí)和長時(shí)記憶、記憶的保持和鞏固都有影響。鑒于睡眠剝奪對(duì)記憶的影響已有大量的實(shí)驗(yàn)證明，所以本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)時(shí)，未設(shè)正常對(duì)照組，即肯定了睡眠剝奪對(duì)記憶的不良作用。本實(shí)驗(yàn)中Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶的測(cè)試顯示，進(jìn)行L-蘋果酸灌胃組的大鼠在同樣的睡眠剝奪條件下學(xué)習(xí)記憶能力明顯強(qiáng)于生理鹽水組，即L-蘋果酸對(duì)睡眠剝奪大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯的改善作用，進(jìn)一步完善了L-蘋果酸可以改善腦組織的能量代謝，調(diào)整腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，有利于學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)，對(duì)學(xué)習(xí)記憶有明顯的改善作用［5］這一論斷。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果SD48 h比SD72 h反應(yīng)時(shí)長，原因可能是Morris水迷宮訓(xùn)練是在睡眠剝奪之前進(jìn)行的，相隔2 d進(jìn)行SD48 h記憶測(cè)試，再隔一天進(jìn)行SD72 h記憶測(cè)試，前者比后者相隔時(shí)間長，遺忘較多。也就是說進(jìn)行48 h記憶測(cè)試相當(dāng)于又對(duì)大鼠進(jìn)行了一次水迷宮學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練，所以睡眠剝奪72 h比48 h反應(yīng)時(shí)短。L-蘋果酸對(duì)于睡眠剝奪后學(xué)習(xí)記憶功能的影響為進(jìn)行夜間作業(yè)的人員的保健具有重要意義，為尋找合適的保健藥物提供了一條新的思路。

［1］Corsi CM，Arce C，Del Rio Portilla IY，et al.Amplitud reduction in visual event related potentials as a function of sleep deprivation.Sleep，1999，22(1):181.

［2］吳清平，周小燕.L-蘋果酸研究進(jìn)展.微生物學(xué)通報(bào)，1990，17(1):30-33.

［3］周紅宇鄭國統(tǒng)張士善.谷氨酸脫羧酶抑制劑L-蘋果酸對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1996，31(12):897-900.

［4］Sucheki D，Palma BD，Tufik S.Sleep rebound in animals deprived of paradoxical sleep by the modified multiple platform method.Brain Res，2000，875:14222.

［5］Morris R.Development of a water maze procedure for studying spacial learning in the rat.Neurosci Methods，1984，11:47.

［6］Bueno OFA，Lobo LL，Olivedra MGM，et al，Dissociated paradoxical sleep deprivation effects on inhibiting avoidance and conditioned fear.Physiol Behav，1994，56(4):775-779.