王紅艷， 朱建星

(沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽 110142)

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)的一群酶類，固定化中性蛋白酶可應(yīng)用于啤酒澄清、各種蛋白水解液的制備等方面.構(gòu)建性能優(yōu)良的載體往往是酶固定化成功與否的關(guān)鍵.殼聚糖(Chitosan，CS)是地球上僅次于纖維素的第二大類天然高分子材料，殼聚糖分子鏈上含有大量的氨基和羥基，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、無毒，以及可生物降解、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，易于制成膜、多孔微珠、凝膠、納米粒子等多種形態(tài).殼聚糖被選擇作為固定化載體，在固定化酶并保持其活性方面有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)［1-4］.在幾類固定化方法中，以共價(jià)結(jié)合法制備的固定化酶性能最為穩(wěn)定，符合工業(yè)化要求.研究表明，增加載體的親水性、增加載體活性側(cè)基手臂分子的長度甚至構(gòu)建所謂“柔性鏈”有利于提高固定化酶活性［2-6］.

為適應(yīng)酶法生產(chǎn)工藝的實(shí)際要求，本文先從微米級(jí)單分散殼聚糖微球樹脂出發(fā)，經(jīng)氨基保護(hù)、C6羥基環(huán)氧化后與親水性多胺偶聯(lián)，制備多胺化殼聚糖微球載體，與未經(jīng)多胺修飾的殼聚糖微球相比較，考察該偶聯(lián)了親水多胺分子鏈的殼聚糖微球載體對(duì)AS1.398中性蛋白酶的固定化效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要藥品及儀器

殼聚糖，脫乙酰度86.9%，濟(jì)南海得貝海洋生物有限公司，CS微球，實(shí)驗(yàn)室自制;環(huán)氧氯丙烷，AR，沈陽市新西試劑廠;四乙烯五胺，CP，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;AS1.398中性蛋白酶，北京東盛華強(qiáng)生物技術(shù)有限公司，50 000 U/g.其他試劑均為分析純.

電動(dòng)攪拌器，常州國華JJ-1;恒溫振蕩器，常州國華SHA-B;掃描電鏡，JEOL JSM-6360LV;紫外分光光度計(jì)，尤尼柯UV2000.

1.2 多胺化殼聚糖微球的制備

按文獻(xiàn)［6］方法，略有改進(jìn):稱取CS微球5 g于100 mL甲醇中，滴加25 mL苯甲醛，于恒溫振蕩器中60℃反應(yīng)16 h，抽濾洗滌后將微球(殼聚糖的苯甲醛Schiff堿)浸泡在適量氫氧化鈉溶液中、加入60 mL環(huán)氧氯丙烷，50℃恒溫振蕩反應(yīng)4 h，抽濾洗滌后將環(huán)氧化微球置于100 mL乙醇中，加入100 mL四乙烯五胺或聚乙烯亞胺、適量氫氧化鈉水溶液，55℃反應(yīng)6 h，抽濾，最后將胺化反應(yīng)產(chǎn)物加入0.25 mol/L的鹽酸中攪拌48 h脫醛，調(diào)pH值到弱堿性后用蒸餾水充分洗滌，干燥，得終產(chǎn)品多胺化殼聚糖微球.以酸堿滴定法測定微球的氨基含量.

1.3 中性蛋白酶的固定化

稱取適量多胺化殼聚糖微球置于燒瓶中，按5～6倍氨基摩爾數(shù)的量加入戊二醛，于乙醇中60℃反應(yīng)2 h，然后用蒸餾水、pH=8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，真空干燥，稱取干燥產(chǎn)品0.3 g于50 mL的三角瓶中，加入1 mL質(zhì)量濃度為5 g/L的中性蛋白酶溶液(經(jīng)紗布過濾)和19 mL的Tris-HCl緩沖液，室溫下連續(xù)振蕩反應(yīng)20 h，固定化酶用緩沖液洗滌數(shù)次，備用.

1.4 酶的活力測定

在錐形瓶中依次加入1 mL酶液(或0.3 g固定化酶)，加入10 mL已40℃預(yù)熱5 min的酪蛋白溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，pH=7.5的Tris-HCl緩沖液配制)，40℃振蕩反應(yīng)10 min，然后加入10 mL三氯乙酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，振搖，過濾，用Folin試劑顯色法測定濾液中的酪氨酸含量，以每分鐘釋放1 μg的酪氨酸的酶量定義為一個(gè)活力單位(U).

固定化酶的活力回收率=(固定化酶總活力/加入的游離酶總活力)×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體的表面形貌

圖1所示為固定化載體微球的SEM照片.

圖1 固定化載體微球的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of immobilization support microspheres

從圖1可以看出，多胺化殼聚糖微球粒徑為60 ～200 μm，多數(shù)粒徑分布在 100 μm 左右，較為均一，表面較光滑，這有利于減少固定化酶催化反應(yīng)過程中的擴(kuò)散限制效應(yīng)的不利影響.

2.2 酶用量對(duì)固定化酶活力回收率的影響

考慮到節(jié)能，未選擇低溫或高于酶的最適作用溫度下進(jìn)行固定化.在室溫，pH=8.0的條件下以不同酶用量固定20 h，制備固定化酶，結(jié)果如圖2所示.

圖2 酶用量對(duì)固定化酶活力及活力回收率的影響Fig.2 Effect of amount of enzyme on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖2可知，隨著游離酶投加量的增加(固定化時(shí)加入的游離酶質(zhì)量濃度增大)，固定化酶活力在不斷升高，游離酶質(zhì)量濃度1～5 g·L-1時(shí)固定化酶活力上升的速度快，給酶量大(游離酶質(zhì)量濃度大于5 g·L-1)時(shí)固定化酶活力增加趨緩.由圖2還可知，酶用量增加時(shí)，活力回收率由60%左右不斷下降.其原因之一是固定化體系中的酶分子達(dá)到一定濃度時(shí)，被固定在載體表面的酶分子數(shù)量趨于飽和，當(dāng)酶用量再增加時(shí)，被固定化的酶量并未增加或增加很少，表現(xiàn)為酶活力回收率下降.加入的游離酶濃度越大，固定化酶的活力回收率越低.另一方面，固定化反應(yīng)體系中的酶量多時(shí)，一部分酶分子被非定向固定化在載體表面，這些酶分子的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生改變甚至活性中心被遮蔽，造成這些酶分子的活力降低甚至失活(無效固定化)，從而使固定化酶的表觀活力未與被固定的酶蛋白量成比例增加，酶活力回收率亦下降.為兼顧固定化酶活力和酶活力回收率，選擇適中的酶溶液質(zhì)量濃度5 g·L-1，這樣可既保證有較高的固定化酶活力回收率(49%)，同時(shí)固定化酶活也較高(384 U·g-1).

2.3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響

投加的游離酶質(zhì)量濃度為5 g·L-1，在室溫，pH=8.0的條件下對(duì)中性蛋白酶分別固定化不同時(shí)間，測定固定化酶的活力回收率，結(jié)果如圖3所示.

圖3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.3 Effect of immobilization time on recovery of immobilized enzyme

由圖3可知:固定化時(shí)間少于20 h時(shí)，固定化酶的活力上升較快，于20～25 h固定化酶活力回收率趨于穩(wěn)定，達(dá)到50%，隨后下降.這是因?yàn)樵诠潭ɑ跏茧A段酶分子以較快速度與載體結(jié)合，表現(xiàn)為固定化酶活力迅速上升;隨著時(shí)間的延長，載體表面結(jié)合的酶分子越來越多而發(fā)生擁擠，導(dǎo)致部分酶分子的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生細(xì)微變化，甚至有一些酶分子的活性中心被遮蔽，影響了底物及產(chǎn)物的傳質(zhì)擴(kuò)散，使部分被固定的酶分子的活力下降，當(dāng)之后新固定上去的酶分子帶來的活力增加量與已被固定的酶分子的活力下降幅度相當(dāng)時(shí)，表現(xiàn)為固定化酶活力增加趨緩;當(dāng)固定化后期，載體表面結(jié)合的酶分子數(shù)量已經(jīng)趨于飽和，活力下降的酶分子數(shù)亦較多，體系中酶分子的穩(wěn)定性隨振蕩時(shí)間的延長也出現(xiàn)下降，從而使固定化酶的表觀活力下降.綜上，最適固定化時(shí)間可確定為20 h.

2.4 固定化pH值對(duì)固定化酶活力回收率的影響

投加的游離酶質(zhì)量濃度為5 g·L-1，于室溫下分別在不同pH值條件下對(duì)中性蛋白酶固定化20 h，測定固定化酶的活力回收率，結(jié)果哪圖4所示.從圖4可看出，該固定化過程的最適pH值為8.0.

圖4 固定化pH對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.4 Effect of pH value on recovery of immobilized enzyme

2.5 多胺化殼聚糖微球與殼聚糖微球固定化效果的比較

用殼聚糖微球和多胺化殼聚糖微球載體分別經(jīng)戊二醛活化后，分別以最優(yōu)條件對(duì)中性蛋白酶進(jìn)行固定，結(jié)果見表1.由表1可知，采用多胺化殼聚糖微球載體制備的固定化中性蛋白酶活力回收率達(dá)40%～50%，遠(yuǎn)高于采用未經(jīng)多胺修飾的殼聚糖微球固定化中性蛋白酶的活力回收率.

表1 多胺化殼聚糖微球與殼聚糖微球固定化中性蛋白酶的比較Table 1 Comparison of immobilized neutral proteinase on different supports

圖5所示為殼聚糖和多胺化殼聚糖的結(jié)構(gòu).對(duì)比殼聚糖和多胺化殼聚糖的結(jié)構(gòu)可知:殼聚糖微球經(jīng)多胺化修飾后的氨基含量大大提高，使之與戊二醛的活化連接位點(diǎn)數(shù)量大大增加，也即提高了酶裝載量;且由于酶分子與載體微球之間間隔有親水性多胺分子，不僅可減小底物分子向酶活性中心擴(kuò)散限制阻力，還可在反應(yīng)體系中賦予被固定的酶分子一定的自由度，有利于保持酶分子在游離狀態(tài)下的活性構(gòu)象，從而獲得較高的酶活.

圖5 殼聚糖和多胺化殼聚糖的結(jié)構(gòu)Fig.5 Configuration of Chitosan and polyamine Modified Chitosan

2.6 固定化酶的性能

2.6.1 熱穩(wěn)定性

將固定化酶及游離酶在70℃下保溫1 h之后，再在40℃下測酶活力，發(fā)現(xiàn)固定化酶活力仍有原活力的62%，而游離酶保溫后活力只有原活力的20%，因此固定化酶具有較好的熱穩(wěn)定性.

2.6.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將固定化酶在4℃下儲(chǔ)存30 d后，仍保留有原活力的78%，而游離酶在4℃下儲(chǔ)存5 d后，其活力只為初始酶活力的一半，由此可見，固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離酶.

2.6.3 操作穩(wěn)定性

固定化中性蛋白酶連續(xù)使用不同批次后的相對(duì)活力變化結(jié)果見表2.

表2 固定化酶的連續(xù)使用穩(wěn)定性Table 2 Use stability of immobilized enzyme

由表2可見，固定化酶連續(xù)重復(fù)使用9批次后仍保留有原固定化酶活力的一半.

3 結(jié)論

從制備的單分散殼聚糖微球樹脂出發(fā)，經(jīng)氨基保護(hù)、C6羥基環(huán)氧化、多胺化、脫醛等步驟制備了微米級(jí)多胺化殼聚糖固定化載體，氨基含量提高2倍以上.該載體對(duì)中性蛋白酶固定化效果較好，最佳固定化條件為:游離酶投加的質(zhì)量濃度為5 g·L-1，25℃，pH=8的條件下固定中性蛋白酶20 h，固定化酶表觀活力最高達(dá)384 U/g，固定化酶活力回收率達(dá)49%，是采用未改性殼聚糖微球固定化的2.7倍.該固定化中性蛋白酶的穩(wěn)定性較好，熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶.

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