周麗卿，杜雙奎*，趙 佳，楊紅丹

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

響應面法優(yōu)化鷹嘴豆蛋白提取工藝

周麗卿，杜雙奎*，趙 佳，楊紅丹

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

以脫脂鷹嘴豆粉為材料，采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白，利用單因素試驗和響應面法對鷹嘴豆蛋白的提取工藝條件進行分析與優(yōu)化。結果表明，堿溶酸沉工藝參數對鷹嘴豆蛋白提取率有顯著影響，因素影響主次順序為pH值＞液料比＞提取時間。鷹嘴豆蛋白堿溶酸沉提取優(yōu)化工藝參數：pH11.0、液料比17.7:1(mL/g)、提取時間88.4min、提取溫度20℃，蛋白提取率達到82.33%。所得鷹嘴豆蛋白提取回歸模型高度顯著(R2＝0.9630)，擬合性好，可用于預測蛋白提取率。

鷹嘴豆蛋白；工藝參數；響應面優(yōu)化

鷹嘴豆(Cicer arietinum L)，屬野豌豆族[1]，為一年生或多年生草本植物，是豆科植物中的稀有品種，因其種子外形獨特，類似鷹嘴而被稱為鷹嘴豆。鷹嘴豆耐干早、耐貧瘠，主要分布在溫暖而又比較干早的地區(qū)，如印度、巴基斯坦、墨西哥等。20世紀80年代在我國新疆、甘肅、青海、云南等地試種，是世界第二大消費豆類，產量居世界豆類第二[2-3]。近幾年，我國鷹嘴豆產量成倍增長，具有“鷹嘴豆之鄉(xiāng)”之稱的新疆木壘縣目前已經形成了10萬畝的鷹嘴豆種植面積，占我國鷹嘴豆種植面積的83%。植物蛋白是人類所需蛋白質的重要來源之一，是解決當前世界人口日益膨脹問題的一種新的食物蛋白來源[4]。鷹嘴豆蛋白含量因種的不同而有較大差異，在15%～30%之間。鷹嘴豆蛋白是一種低過敏性、高生物效價的優(yōu)質植物蛋白質，蛋白質功效比值、氨基酸含量和消化率等均優(yōu)于其他豆類，如木豆、綠豆[5-6]，被譽為“黃金豆”、“珍珠果仁”。我國平均每人每天攝入的蛋白質含量約為80g，相比發(fā)達國家，我國蛋白質的攝入量還處在較低水平[7]。鷹嘴豆蛋白作為一種新型植物蛋白資源，開發(fā)利用鷹嘴豆蛋白對緩解我國蛋白質資源緊張有重要意義。

目前，有關鷹嘴豆的研究主要集中在對其藥理作用的探討[1,8-9]，而對鷹嘴豆蛋白資源綜合利用報道較少。本研究以鷹嘴豆為原料，采用堿溶酸沉法提取蛋白質，研究提取工藝，優(yōu)化工藝參數，旨在為鷹嘴豆蛋白的提取及綜合開發(fā)利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆 新疆大龍王食品有限責任公司；G-250考馬斯亮藍 科邦生物公司；石油醚(30～60℃) 天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

UV mini-1240型紫外分光光度計 日本島津公司；KJELTEC2100型半自動凱式定氮儀 瑞典富斯-特卡托公司；PHS-3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；HJ-3型數碼恒溫磁力攪拌器 福州精科儀器儀表有限公司；KDC-40型低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

豆粉制備：用水浸泡鷹嘴豆過夜，撈去雜物，瀝去水分，采用手工去皮，40℃烘干后，高速粉碎機粉碎，過8 0目篩，裝自封袋4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

豆粉脫脂：取4L石油醚加入到2kg豆粉中，室溫下連續(xù)攪拌60min，豆粉自然沉降與上層有機溶劑分離，傾出有機溶劑進行回收，沉淀豆粉再加石油醚重復上述操作2次。隨后將鷹嘴豆粉置于通風櫥中室溫干燥12h，將處理好的脫脂豆粉裝自封袋中4℃保存、備用。

1.3.2 鷹嘴豆蛋白的提取

采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白[10]。

工藝步驟：脫脂鷹嘴豆粉→堿溶、浸提→離心→等電點沉淀→洗滌→低溫干燥→鷹嘴豆蛋白。

1.3.3 鷹嘴豆蛋白等電點測定

采用紫外分光光度法測定[10]。

1.3.4 鷹嘴豆總蛋白含量測定

按GB/T 5511－2008《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白質含量計算：凱氏法》方法進行[11]。

1.3.5 鷹嘴豆提取的蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法[12]?？捡R斯亮藍法測定蛋白質含量的標準曲線方程為：A＝0.0066C－0.0002，R2＝0.9987(其A為吸光度，C為蛋白質質量濃度/(μg/mL))，表明在一定范圍內，蛋白質質量濃度與吸光度呈線性關系。

樣品蛋白含量測定：用2mol/L NaOH溶液將堿溶酸沉法提取得到的蛋白質溶解，定容至25mL。吸取10μL蛋白液，測定其蛋白含量，再換算成25mL蛋白液中的蛋白含量即為提取的蛋白含量。

1.3.6 鷹嘴豆蛋白提取單因素試驗

以提取鷹嘴豆蛋白的pH值、液料比、時間、溫度為試驗因素，以鷹嘴豆蛋白提取率作為試驗指標，分別做單因素試驗，以分析各因素對鷹嘴豆蛋白提取率的影響。

1.3.7 鷹嘴豆蛋白質提取工藝的響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取提取pH值、提取液料比、提取時間為試驗因素，以蛋白提取率為響應指標，設計Box-Behnken試驗。

2 結果與分析

2.1 鷹嘴豆蛋白等電點的確定

圖1 吸光度隨pH值變化曲線Fig.1 Absorbance of extract supernatant of chickpea with pH

由圖1可以看出，隨著pH值變化，上清液的吸光度先減小后增大。當pH4.3時，上清液的吸光度最小，表明上清液中殘留的蛋白質含量最少，此時，體系pH值為蛋白質的等電點，蛋白質凈的正、負電荷數總和為零，蛋白質-蛋白質間靜電排斥作用降低而聚合沉淀。表明鷹嘴豆蛋白質的等電點pI＝4.30，這與Boye等[13]報道的鷹嘴豆蛋白的pI值一致。

2.2 鷹嘴豆蛋白提取工藝單因素試驗

2.2.1 pH值的選擇

圖2 pH值對鷹嘴豆蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction rate of chickpea protein

在提取溫度20℃、液料比10:1、提取時間60min條件，pH值對鷹嘴豆蛋白提取率的影響結果見圖2。

從圖2可以看出，pH值對鷹嘴豆蛋白質提取率有顯著影響。隨著浸提溶液pH值升高，提取率呈上升趨勢，堿性條件下的提取率顯著高于酸性條件下，pH10～12提取率差異不顯著，這與一般植物蛋白在不同pH值下的溶解規(guī)律一致，但pH值過高會導致蛋白質發(fā)生不利的化學反應，如影響產品色澤，形成有毒的縮和氨基酸，從而降低蛋白質食用價值[14]。綜合考慮，選擇pH值范圍為9～11。

2.2.2 液料比的確定

在提取溫度20℃、pH8.0、提取時間60min條件下，液料比對鷹嘴豆蛋白提取率的影響結果見圖3。

圖3 液料比對鷹嘴豆蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of chickpea protein

從圖3可知，當液料比在5:1～20:1變化時，隨著提取溶劑比例的增加，提取率增大。但當液料比繼續(xù)增加時，蛋白質提取率下降。因為適當增大液料比，有利于蛋白質的充分溶出，而使提取率增大[15-16]。但液料比過大，使得蛋白質分子與水分子之間的相互作用增加，使得蛋白質分子不容易沉淀，在酸沉時會導致蛋白質流失到上清液，反而造成蛋白質損失[17]。因此，合適液料比為20:1。

2.2.3 提取時間的選擇

在提取溫度20℃、pH8.0、液料比10:1條件下，提取時間對鷹嘴豆蛋白提取率的影響結果見圖4。

圖4 提取時間對鷹嘴豆蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of chickpea protein

由圖4可知，隨著提取時間延長，蛋白質提取率呈現先增加后降低趨勢，當提取時間為80min，鷹嘴豆蛋白的提取率達到最大。分析原因可能是由于一定時間后，蛋白的溶出達到飽和，則溶出率趨于平衡，若再進一步延長浸提時間，可能因為長時間的攪拌使蛋白質變性，從而使提取率降低[17]。還有可能是鷹嘴豆淀粉與蛋白質發(fā)生結合，從而導致蛋白質難以溶出[10]，因此提取時間選擇80min。

2.2.4 提取溫度的選擇

在pH8.0、液料比10:1、提取時間60min條件下，提取溫度對鷹嘴豆蛋白提取率的影響結果見圖5。

圖5 提取溫度對鷹嘴豆蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of chickpea protein

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，蛋白質提取率呈現先降低后增加的趨勢，但變化幅度不明顯。在30℃時出現低谷，可能是因為溫度升高導致部分易變性蛋白質變性，其蛋白質提取率降低與部分熱變性溫度較高的蛋白質提取率增加共同作用的結果。不同提取溫度下鷹嘴豆蛋白質提取率沒有顯著差異。因此，從節(jié)約能源及簡化提取工藝考慮，提取溫度采用20℃。

2.3 鷹嘴豆蛋白提取工藝參數的優(yōu)化

2.3.1 回歸模型的建立

響應曲面設計的因素水平編碼見表1，試驗方案及結果見表2。每個試驗組合重復試驗2次，取其平均值作為提取率結果，試驗結果采用Design-Expert 7.0.0軟件分析。

表1 鷹嘴豆蛋白提取工藝Box - Behnken設計因素及水平編碼Table 1 Variables and their coded levels for Box-Behnken design

對表2試驗結果進行多元回歸擬合，得鷹嘴豆蛋白質得率對pH(X1)、液料比(X2)和提取時間(X3)的二次多項式回歸模型為：

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the established regression model

表4 回歸系數的顯著性檢驗Table 4 Significance test of each regression coefficient

由回歸模型方差分析結果可以看出(表3)，模型P＝0.0003＜0.01，高度顯著，失擬項P＝0.2802＞0.05不顯著，表明所建立的回歸二次模型成立，可用此模型來分析和預測蛋白質堿溶酸沉提取工藝參數。由表4回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，X1、X2、X1X2對鷹嘴豆蛋白質提取率的影響高度顯著，X3、X1X3、X12對鷹嘴豆蛋白質提取率的影響顯著，X2X3、X32、X22對鷹嘴豆蛋白質提取率的影響不顯著。影響蛋白質提取率的主次因素依次為A＞B＞C，即pH值＞液料比＞提取時間。

2.3.2 響應曲面分析

圖6 兩因素及其交互作用響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of chickpea protein

由圖6a可知，提取時間為60min時，隨著pH值的升高，在低液料比下，蛋白質提取率呈增大趨勢，但在高液料比下，蛋白質提取率卻呈現出下降趨勢，這與液料比與pH值之間負交互作用高度顯著有關。由圖6b可以看出，液料比為20:1，在提取時間為較低水平時，蛋白質提取率隨著pH值升高呈先升高后降低趨勢。當提取時間延長，提取液的pH增大時，蛋白提取率達最大。

對回歸模型分析，得鷹嘴豆蛋白堿溶優(yōu)化工藝參數為pH11.0、液料比17.7:1和時間88.4min，鷹嘴豆蛋白理論提取率可達83..47%。對優(yōu)化參數進行3次重復驗證實驗得鷹嘴豆蛋白提取率為82.33%，與理論值偏差1.38%，沒有顯著差異。

3 結 論

采用Box-Behnken設計，建立了堿溶酸沉法鷹嘴豆蛋白提取工藝參數的二次多項式數學模型，經檢驗該模型是合理可靠的，能夠較好地預測鷹嘴豆蛋白的提取率。堿溶酸沉法工藝參數對鷹嘴豆蛋白提取率有顯著影響，因素影響主次順序為pH值＞液料比＞提取時間。鷹嘴豆蛋白提取優(yōu)化工藝參數為pH11.0、液料比17.7:1、時間88.4min、提取溫度20℃，鷹嘴豆蛋白提取率可達82.33%。因此，利用響應面分析方法對堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白工藝進行優(yōu)化，獲得優(yōu)化工藝參數，可為工業(yè)化蛋白提取提供理論依據和指導。

[1] 楊建梅, 張慧, 余琛, 等. 鷹嘴豆的研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2010, 12(1): 89-90.

[2] 張濤, 江波, 王璋. 鷹嘴豆分離蛋白質的特性[J].食品與生物技術學報, 2010, 38(10): 145-158.

[3] POLTRONIERI F, AREAS J A G, COLLI C. Extrusion and iron bioavailability in chiekpea (Cicer arietinum L.)[J]. Food Chem, 2000,70(2): 175-178.

[4] 饒國華, 趙謀明, 林偉鋒, 等. 低次煙葉蛋白質提取工藝研究[J]. 西北農林科技大學學報: 自然科學版, 2005, 33(11): 67-72.

[5] ZER S, KARAKY T, TOKLU F, et al. Nutritional and physicochemical variation in Turkish kabuli chickpea (Cicer arietinum L.) landraces[J]. Euphytica, 2010, 175(2): 237-249.

[6] ERCAN R, KKSEL H, ATLI A, et al. Cooking quality andcomposition of chickpea grown in Turkey[J]. Gida, 1995, 20(5): 289-293.

[7] CHIESA S, GNANSOUNOU E. Protein extraction from biomass in a bioethanol refinery-possible dietary applications: use as animal feed and potential extension to human consumption[J]. Bioresource Technology,2011, 102(2): 427-436.

[8] 全智慧, 徐暾海. 鷹嘴豆的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(12):3111-3112.

[9] 包興國, 楊蕊菊, 舒秋萍. 鷹嘴豆的綜合開發(fā)與利用[J]. 草業(yè)科學,2006, 23(10): 34-37.

[10] 朱振寶, 易建華. 堿溶酸沉法提取甜蕎麥蛋白及其氨基酸分析[J]. 食品科技, 2009, 34(8): 193-197.

[11] 全國糧油標準化技術委員會. GB/T 5511—2008 谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白質含量計算[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[12] 李鳳英, 崔蕊靜, 李春華. 葡萄籽蛋白質的提取工藝研究[J]. 中國油脂, 2005, 30(4): 36-39.

[13] BOYE J I, AKSAY, S, ROUFIK, S, et al. Comparison of the functional properties of pea, chickpea and lentil protein concentrates processed using ultra ltration and isoelectric precipitation techniques[J]. Food Research International, 2010, 43(2): 537-546.

[14] 管斌, 林洪, 王廣策. 食品蛋白質化學[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社,2005: 335-336.

[15] 鄧紅, 田蕓蕓, 田子卿. 響應曲面法優(yōu)化文冠果種仁蛋白的堿溶酸沉提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(8): 197-323.

[16] SUN Xiaohong, ZHU Kexue, ZHOU Huiming. Optimization of a novel backward extraction of defatted wheat germ protein from reverse micelles[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009(10):328-333.

[17] 矯麗媛, 呂敬軍, 陸豐升. 花生分離蛋白提取工藝優(yōu)化研究[J]. 食品科學, 2010, 31(10): 196-201.

Optimization of Chickpea Protein Extraction Using Response Surface Methodology

ZHOU Li-qing，DU Shuang-kui*，ZHAO Jia，YANG Hong-dan
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The purpose of the present study was to optimize alkali protein extraction from defatted chickpea using one-factorat-a-a-time method and response surface methodology. The results showed that all investigated parameters had a notable effect on the extraction yield of chicken protein and could be ranked in decreasing order of importance in their effects as follows: pH ＞liquid-to-material ratio＞extraction time. The optimal extraction parameters were pH 11.0 and 17.7:1 (mL/g) of liquid-to-material ratio for 88.4 min of extraction at 20 ℃, resulting in an extraction yield of 82.33%. The established regression model describing the extraction yield of chicken protein as a function of three extraction parameters was highly significant (R2＝0.9630). The predictive and experimental results were found to be in good agreement. Thus, the model was applicable for the prediction of protein yield.

chickpea protein；process parameters；response surface optimization

TS214.9

A

1002-6630(2012)08-0066-05

2011-04-09

陜西省科技廳科技攻關項目(2008K01-02)

周麗卿(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為雜豆開發(fā)與利用。E-mail：zhouliqingisagirl@yahoo.com.cn

*通信作者：杜雙奎(1972—)，男，副教授，博士，研究方向為雜糧資源開發(fā)與利用。E-mail：dushuangkui@nwsuaf.edu.cn