趙亞娟，郇延軍，孫冬梅，閆曉蕾，許 偉

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理特性及其轉(zhuǎn)化硝酸鹽影響因素的研究

趙亞娟，郇延軍*，孫冬梅，閆曉蕾，許 偉

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

對普遍存在于發(fā)酵肉制品中具有硝酸還原酶活性的2種外源性木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理生化特性進(jìn)行了鑒定，并研究了不同溫度、pH、鹽含量對兩菌株及不同混合配比菌株生成亞硝酸鹽量的影響。結(jié)果表明：兩菌株均具有較強(qiáng)的耐鹽性、耐亞硝性、耐硝酸鹽性，且在30、40℃，pH6.5，2%NaCl時(shí)生成亞硝酸鹽速率最快。生理生化等鑒定實(shí)驗(yàn)表明，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌可為發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中的優(yōu)良菌株選擇和應(yīng)用提供理論參考。

木糖葡萄球菌，肉糖葡萄球菌，硝酸鹽還原，亞硝酸鹽生成速率

硝酸鹽和亞硝酸鹽是肉制品加工中常用的添加劑，具有護(hù)色、抑制微生物生長的作用，特別是能夠抑制肉毒梭狀芽孢桿菌生長，同時(shí)還具有提升腌臘風(fēng)味的作用。但M irvish和Sen等研究發(fā)現(xiàn)，肉中NaNO2的濃度與亞硝胺產(chǎn)生密切相關(guān)，尤其是直接使用亞硝酸鹽加工初期，肉中亞硝酸鹽濃度較高，給亞硝胺大量生成創(chuàng)造了機(jī)會(huì)[1]。然而，在較長時(shí)間腌制和發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中，通常使用硝酸鹽或硝酸鹽與亞硝酸鹽混合物。硝酸鹽可以在肉中還原性物質(zhì)和產(chǎn)硝酸鹽還原酶的微生物作用下，慢慢轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，可避免直接使用亞硝酸鹽帶來的生產(chǎn)過程初期亞硝酸鹽濃度過高等問題。2005年美國農(nóng)業(yè)部提出了“天然肉制品”概念。這類產(chǎn)品生產(chǎn)中，所有配料必須是天然的[2]。而作為替代硝酸鹽和亞硝酸鹽天然配料的研究目前主要集中在使用芹菜和蘭花菜等富含硝酸鹽蔬菜上。Sebranek和Bacus[2]對應(yīng)用芹菜粉和肉糖葡萄球菌進(jìn)行肉制品加工做了簡要介紹；Sindelar[3]等在牛肉干加工過程也應(yīng)用了富含硝酸鹽蔬菜。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵肉制品中的木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和一些微球菌是主要的產(chǎn)硝酸鹽還原酶的微生物[2-4]。王永霞[6]、于長青[7]、Casaburi[8]等人對木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌具有硝酸還原酶活性進(jìn)行了驗(yàn)證。硝酸鹽在肉制品中添加使用歷史很久，但對其轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的影響因素沒有細(xì)致研究。本文擬將研究2種外源性木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理生化特性，并對其轉(zhuǎn)化硝酸鹽影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)分析和研究，以期為控制硝酸鹽的轉(zhuǎn)化和天然發(fā)酵肉制品品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylose，S.xylosus）、肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus，S.carnosus）均購于廣東省微生物菌種保藏中心（GIMCC）。

高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，生化培養(yǎng)箱，電子分析天平，UV2600紫外分光光度計(jì)，梅特勒－托利多（FE20）pH計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物生理生化特性測定

1.2.1.1 生長曲線測定 將肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化后，轉(zhuǎn)接于空白新鮮液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，用分光光度計(jì)在可見光600nm處，每隔2h測定其OD600值，以空白培養(yǎng)基作為對照。

1.2.1.2 菌株耐鹽能力的測定 在含0、3%、6%、9%、12%NaCl的100m L新鮮營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，分別接種1m L的在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h的菌懸液，37℃培養(yǎng)24h后測定其OD600值，以空白液體培養(yǎng)基作為對照。

1.2.1.3 菌株耐亞硝酸鹽能力的測定 在含0、50、100、150mg/kg NaNO3的100m L新鮮營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，分別接種1m L的在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h的菌懸液，37℃培養(yǎng)24h后測定其OD600值，以空白液體培養(yǎng)基作為對照。

1.2.1.4 菌株耐硝酸鹽能力的測定 在含0、50、100、150mg/kg NaNO3的100m L新鮮營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，分別接種1m L的在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h的菌懸液，37℃培養(yǎng)24h后測定其OD600值，以空白液體培養(yǎng)基作為對照。

1.2.2 溫度對亞硝酸鹽生成速率的影響 將在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌株分五組：單一的木糖葡萄球菌；單一的肉糖葡萄球菌；木糖葡萄球菌與肉糖葡萄球菌1∶1比例混合；木糖葡萄球菌與肉糖葡萄球菌1∶2比例混合；木糖葡萄球菌與肉糖葡萄球菌2∶1比例混合，分別接種于10m L含有250mg/kg NaNO3[8]的液體培養(yǎng)基中，放置在30、40、53℃條件下培養(yǎng)。每組接種量均為107cfu/g。用分光光度計(jì)法在波長538nm處測定溶液中亞硝酸鹽生成量。以新鮮液體培養(yǎng)基及檢測亞硝酸鹽所用試劑為空白對照。

1.2.3 pH對亞硝酸鹽生成速率的影響 將在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌株分組（同1.2.2），分別接種于pH為5.0、5.5、6.0、6.5的含有250mg/kg NaNO3[8]的10m L的液體培養(yǎng)基中。每組接種量均為107cfu/g。用分光光度計(jì)法在波長538nm處測定溶液中亞硝酸鹽生成量。以新鮮液體培養(yǎng)基及檢測亞硝酸鹽所用試劑為空白對照。

1.2.4 鹽含量對亞硝酸鹽生成速率的影響 將在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌株分組（同1.2.2），分別接種于鹽含量為2%、5%、10%的含有250mg/kg NaNO3[8]的10m L液體培養(yǎng)基中[8]。每組接種量均為107cfu/g。用分光光度計(jì)法在波長538nm處測定溶液中亞硝酸鹽生成量。以新鮮液體培養(yǎng)基及檢測亞硝酸鹽所用試劑為空白對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長曲線

從圖1看出，木糖葡萄球菌在培養(yǎng)4h后進(jìn)入對數(shù)生長期，17h后進(jìn)入穩(wěn)定期；肉糖葡萄球菌在培養(yǎng)6h后進(jìn)入對數(shù)生長期，17h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

對數(shù)期的微生物，生理特性整體較一致，酶系活躍，代謝旺盛，所以選用對數(shù)期的菌種作為實(shí)驗(yàn)菌種。

圖1 菌株生長曲線Fig.1 Growth curves of S.xylosus and S.carnosus

2.2 菌株耐鹽性

表1 不同NaCl濃度下兩菌株的吸光值（A）Table1 Effectof the saltconcentration to S.xylosus&S.carnosus

由表1可知，NaCl含量對兩種菌種生長均有不同程度的影響。木糖葡萄球菌在0～3%NaCl時(shí)生長不受抑制，在6%～12%NaCl時(shí)生長受到一定程度上抑制；而肉糖葡萄球菌在0～12%NaCl時(shí)隨著NaCl濃度增大，生長受到一定程度上抑制?？偟膩碚f，這兩種菌種在3%～6%NaCl時(shí)，均可正常生長。因而，從菌種耐鹽性要求，可選用木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌作為發(fā)酵香腸生產(chǎn)的菌種[9]。

2.3 菌株耐亞硝性

表2 不同亞硝酸鹽濃度下兩菌株的吸光值（A）Table 2 Effectof the nitrite concentration to S.xylosus&

由表2可知，NaNO2濃度對兩種菌種生長均有不同程度的影響。當(dāng)NaNO2濃度從0增加到50mg/kg時(shí)，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的吸光值均增加；當(dāng)NaNO2濃度增加到100mg/kg時(shí)，木糖葡萄球菌生長基本無影響，而肉糖葡萄球菌的吸光值則增加；當(dāng)NaNO2濃度上升到150mg/kg時(shí)，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生長受到影響很小。在應(yīng)用木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生產(chǎn)天然發(fā)酵香腸的過程中，添加芹菜粉、木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌后，芹菜粉中的硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽，由表2可知，亞硝酸鹽的生成不會(huì)對菌株的生長產(chǎn)生抑制作用。

2.4 菌株耐硝酸鹽性

從表3可以看出，隨著NaNO3濃度逐漸增大，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生長受到影響很小。在天然發(fā)酵香腸制作過程中，芹菜粉中含有一定量NaNO3，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌在添加芹菜粉下可以正常生長。

表3 不同硝酸鹽濃度下兩菌株的吸光值（A）Table 3 Effectof the nitrate concentration to S.xylosus& S.carnosus

2.5 溫度對亞硝酸鹽生成速率的影響

圖2 不同溫度下各組菌種的亞硝酸鹽生成速率Fig.2 Effectof nitrite formation rate of each strains at different temperatures

由圖2可以看出，各組菌種在30、40℃時(shí)亞硝酸鹽的生成速率及生成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于53℃時(shí)處理組。圖2（a）中，30℃和40℃下培養(yǎng)的木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌具有較強(qiáng)的硝酸還原酶活性，亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化率分別為54.59%和50.87%；亞硝酸鹽的生成速率及生成量明顯高于53℃情況下的生成速率和生成量；圖2（b）中，30℃和40℃下的亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化率分別為62.85%和55.10%。

Stahnke LH[10]發(fā)現(xiàn)，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌能夠產(chǎn)生酯類和其他來自氨基酸的一些重要風(fēng)味物質(zhì)，M－CMontel等人[11]將接種木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的香腸與不接菌的香腸風(fēng)味對照，發(fā)現(xiàn)前者可以產(chǎn)生一種水果味。從香腸風(fēng)味方面考慮，預(yù)采用混合菌種發(fā)酵劑。圖2（c）、（d）、（e）中顯示的是木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌不同配比混合菌種的亞硝酸鹽生成和變化趨勢，在30℃和40℃時(shí)均有較高的亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化率。

Sindelar利用肉糖葡萄球菌制作天然牛肉干時(shí)，采用40.6℃作為其發(fā)酵溫度[3]；Sebranek研究認(rèn)為天然肉制品的生產(chǎn)均在35～40℃下發(fā)酵[2]。因而，利用木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌中的硝酸還原酶活性能夠還原芹菜粉中的硝酸鹽為亞硝酸鹽，但制作天然發(fā)酵香腸的發(fā)酵溫度以30～40℃左右為宜。

2.6 pH對亞硝酸鹽生成速率的影響

圖3 不同pH條件下各組菌種的亞硝酸鹽生成速率Fig.3 Effectofnitrite formation rateofeach strainsatdifferentpH

由圖3可以看出，各處理組菌種在pH 5.0、5.5、6.0、6.5下均可將硝酸鹽緩慢還原成亞硝酸鹽，在反應(yīng)12h左右，亞硝酸鹽生成速率達(dá)到最大值，且在12～36h內(nèi)亞硝酸鹽含量基本保持穩(wěn)定。圖3（a）中，在0～12h內(nèi)，木糖葡萄球菌在pH 6.0下亞硝酸生成速率最大，12h基本保持不變；反應(yīng)36h后，木糖葡萄球菌在pH6.5下生成的亞硝酸鹽最大。圖3（b）中，0～12h內(nèi)，肉糖葡萄球菌在pH 5.5、6.0、6.5下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的速率明顯高于pH 5.5處理組，且在pH 6.5下生成亞硝酸鹽量最大。圖3（c）、（d）、（e）顯示，3種不同配比的混合菌種在pH6.5下的亞硝酸鹽生成速率均最大，且無明顯差別。3種不同菌種配比組合中，木糖葡萄球菌與肉糖葡萄球菌以1∶2比例混合時(shí)，硝酸鹽還原率最大，達(dá)到59.28%。

在發(fā)酵香腸生產(chǎn)過程中，由于原料加入了食鹽、硝酸鹽和香辛料，使不耐鹽腐敗菌不能生長，加上加工過程中處理溫度一般較低，嗜冷性好氧菌開始時(shí)生長緩慢，促進(jìn)了乳酸菌生長，并使其逐漸成為優(yōu)勢菌。乳酸菌能將原料中的碳水化合物分解為乳酸，導(dǎo)致產(chǎn)品pH下降至5.0左右[12]，由此可見，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌在pH5.0下能夠?qū)⑾跛猁}還原成亞硝酸鹽。

2.7 鹽含量對亞硝酸鹽生成速率的影響

圖4 不同NaCl濃度下各組菌種的亞硝酸鹽生成速率Fig.4 Effect of nitrite formation rate of each strains at different sodium chloride concentration

由圖4可以看出，各處理組菌種在2%、5%和10% NaCl下均可將硝酸鹽緩慢還原成亞硝酸鹽，且以2% NaCl時(shí)亞硝酸鹽生成率為最大，即木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生長性能隨著NaCl濃度增大受到不同程度的抑制，其硝酸還原酶活性可能也會(huì)受到影響，從而影響亞硝酸鹽的生成速率。

在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過程中，隨著水分含量降低，NaCl濃度會(huì)越來越大。在5%和10%NaCl條件下，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的硝酸還原酶仍可以將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，保證了香腸發(fā)酵過程中亞硝酸鹽持續(xù)緩慢生成。

3 結(jié)論

通過對木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌2種菌種的耐鹽性和耐亞硝性的測定，發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌能耐受6%食鹽、150mg/kg亞硝酸鹽及150mg/kg硝酸鹽，且這2種菌種及其不同比例混合菌種在不同溫度、pH、NaCl濃度條件下仍具有硝酸還原酶活性，尤其以30、40℃，pH 6.5，2%NaCl為適宜生長條件。

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Study on physiological，biochem ical characteristics and their influencing factors of nitrate reduction of Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus

ZHAO Ya-juan，HUAN Yan-jun*，SUN Dong-mei，YAN Xiao-lei，XUW ei
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The g row th of Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus which are two main kinds of staphylococcus existing in fermented meat p roduct，were evaluated by the salt-tolerant，nitrite-tolerant and nitrate-tolerant tests and their nitrate reduc tase activity at different tem peratures，pH and NaCl concentrations. The result showed that both of them had strong activity of nitrate reductases at 30，40℃，pH6.5，2%NaCl.The results showed that Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus can p rovide theoretical reference for the selection and app lication of strains in the p roduc tion of fermented sausages.

Staphylococcus xylosus；Staphylococcus carnosus；nitrate reduction；nitrite formation rate

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0063-04

2011－04－20 *通訊聯(lián)系人

趙亞娟（1986-），女，在讀碩士研究生，研究方向：肉品科學(xué)與品質(zhì)控制。

國家自然科學(xué)基金課題（31071569）。